葡萄EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、葡萄是葡萄科葡萄屬植物，是世界上重要的果樹樹種之一。由于栽培歷史悠久，品種數(shù)量龐大，葡萄中很多品種僅憑形態(tài)學(xué)特征難以區(qū)分，同名異物和同物異名等現(xiàn)象比較普遍，需要一種有效的方法對(duì)葡萄屬植物進(jìn)行分類與鑒定。本文利用公共數(shù)據(jù)庫中的葡萄EST序列開發(fā)葡萄SNP位點(diǎn)，建立CAPS標(biāo)記和TSP標(biāo)記的檢測(cè)體系，并在40份葡萄材料中進(jìn)行多態(tài)性分析和聚類分析，旨在為葡萄的親緣關(guān)系鑒定，品種鑒定及分子標(biāo)記輔助育種等方面提供參考。主要研究結(jié)果如下：
　

2、?。?）從NCBI的dbEST數(shù)據(jù)庫中下載來源于9個(gè)不同基因型葡萄的不同組織EST序列42,493條，利用CAP3軟件拼接得到6,126個(gè)重疊群(contig)，將拼接結(jié)果導(dǎo)入QualitySNP進(jìn)行SNP開發(fā)，結(jié)果表明：僅在1,195個(gè)contig中存在候選SNP位點(diǎn)，共5,032個(gè)，其中包括1,800個(gè)顛換類型，2,896個(gè)轉(zhuǎn)換類型，336個(gè)單堿基的插入與缺失（indel），SNP的平均出現(xiàn)頻率為4.2SNP·contig?1。為提

3、高候選SNP位點(diǎn)的可靠度，降低小規(guī)格contig開發(fā)SNP的假陽性率和大規(guī)格contig開發(fā)SNP的假陰性率，設(shè)置候選SNP位點(diǎn)進(jìn)行次要等位基因頻率至少為30％，SNP側(cè)翼序列保守度至少為5bp的人工篩選。
　?。?）建立了25μL的CAPS標(biāo)記反應(yīng)體系為：ddH2O16.8μL，10×Buffer2.5μL，Mg2+1.5mmol·L-1，引物各0.2μmol·L-1，dNTPs0.2mmol·L-1，Taq酶1U，模板DNA5

4、0ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性1min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。
　?。?）建立了25μL的TSP標(biāo)記反應(yīng)體系為：ddH2O15.6μL，10×Buffer2.5μL，Mg2+1.5mmol·L-1，位點(diǎn)特異性引物0.2μmol·L-1，等位基因特異性引物0.96μmol·L-1，dNTPs0.2μmol·L-1，Taq酶1U，模板DNA50ng。反應(yīng)程序?yàn)?/p>

5、：95℃預(yù)變性10min；位點(diǎn)特異性引物與模板DNA結(jié)合階段為15個(gè)循環(huán)：94℃30s，58℃30s，72℃30s；等位基因特異性引物與位點(diǎn)特異性引物競(jìng)爭(zhēng)階段為5個(gè)循環(huán)：94℃10s，45℃30s；最后是等位基因特異性引物與模板DNA結(jié)合階段15個(gè)循環(huán)：94℃30s，53℃30s，72℃5s。
　?。?）共設(shè)計(jì)28對(duì)CAPS標(biāo)記引物和22對(duì)TSP標(biāo)記引物，并在40份葡萄材料中進(jìn)行電泳檢測(cè)，其中20對(duì)CAPS引物和10對(duì)TSP引物電