南方漢族終末期腎功能衰竭患者HLA基因及單倍型多態(tài)性分析.pdf

1、終末期腎功能衰竭(End-stage renal disease,ESRD)是指各種原因造成的慢性進行性腎實質(zhì)損害,致使腎臟明顯萎縮,不能維持其基本功能,臨床出現(xiàn)以代謝產(chǎn)物潴留,水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào),全身各系統(tǒng)受累為主要表現(xiàn)的臨床綜合征,也稱為尿毒癥。各種腎臟疾病持續(xù)進展,最后均可導致終末期腎功能衰竭。據(jù)有關(guān)發(fā)達國家統(tǒng)計,慢性腎衰的發(fā)病率與患病率均有上升趨勢。美國慢性腎衰患者的總數(shù)已達1363萬,其患病率為9.9％o,我國報道終末期

2、腎功能衰竭患者患病率也高達0.1‰。眾所周知,慢性腎衰是一種嚴重危害人民健康和生命的常見病,而且治療費用昂貴,對家庭和社會都造成了沉重的經(jīng)濟負擔。但其發(fā)病機制尚未清楚,除外目前解釋CRF的腎小球高灌注、高壓力、高濾過,腎小球囊內(nèi)高壓,腎小管高代謝及腎臟代償性肥大等理論；腎小球和腎間質(zhì)的變化,腎小球、腎小管間質(zhì)細胞及腎臟浸潤細胞產(chǎn)生的大量免疫炎性細胞因子,也參與了腎功能惡化的過程。
　　 人類白細胞抗原系統(tǒng)是人類主要組織相容性復合

3、體(Major histocompatibitilycomplex,MHC),是編碼HLA的基因群,是人類基因組計劃完成并公布的人體最復雜的免疫復合體。HLA分成三類基因區(qū),Ⅰ類基因包括經(jīng)典的A、B、C位點,非典型區(qū)E、F、G位點等,在免疫系統(tǒng)中起識別自我和非我的功能,因此在免疫系統(tǒng)抵抗病毒和腫瘤中起重要作用；Ⅱ類基因包括經(jīng)典區(qū)DP、DQ、DR.位點,非典型區(qū)DN、DM、DO位點等,其編碼的產(chǎn)物主要與抗原的處理、加工和提呈有關(guān)；Ⅲ類基因

4、包括包括C2、Bf、C4A、C4B等補體成分編碼基因和MIC、LTA、TNF、LTB、HSP70等,其中后者的表達產(chǎn)物與炎癥反應有關(guān)。在1958年經(jīng)Dausset發(fā)現(xiàn),HLA便成為醫(yī)學界最活躍的研究領(lǐng)域之一,最終導致了一門新興的邊緣學科-免疫遺傳學的迅速發(fā)展。隨著研究的逐步深入,HLA在人體生理、病理機制中的重大作用越來越多地被證明,發(fā)現(xiàn)它不僅在移植排斥、免疫應答的遺傳控制和調(diào)節(jié)、免疫細胞的相互識別和限制等方面有重要的意義,而且在與疾病

5、的相關(guān)性方面有著極其重要的臨床價值。
　　 腎臟病多數(shù)是免疫介導的炎癥反應所致,在其發(fā)展過程中有很多免疫炎性因子的參與,如NK細胞,B細胞,T細胞,血小板,粒細胞等,這些免疫活性細胞需要HLA作為免疫反應的配體與其細胞膜上的受體結(jié)合才能發(fā)揮免疫炎性反應。而且有學者對腎衰患者進行腎活檢發(fā)現(xiàn)腎小球系膜區(qū)有HLA-Ⅲ類基因編碼的產(chǎn)物補體C4的沉積,這些均說明HLA在腎臟病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。所以通過研究等候腎移植的終末期腎

6、功能衰竭患者HLA分型資料與健康人群的比較,尋找與ESRD存在易感的HLA基因及單倍型是非常有必要,而且具有實際臨床意義。近年來國外一些移植中心對HLA在導致各類腎臟疾病最終進展為終末期腎功能衰竭進程中所起的免疫遺傳作用做了較多研究,并提出可能的易感基因和保護基因。Rogus JJ等通過家系研究提出1型糖尿病腎病患者并發(fā)終末期腎衰,易感基因在其發(fā)病中起重要作用,并提出易感基因可能位于人六號染色體短臂HLA區(qū)域。KARAHAN GE等報道

7、土耳其587例不同原發(fā)病最終并發(fā)終末期腎衰竭患者高表達HLA-B58,DR3,并認為易感基因的確定可能對延緩腎臟疾病患者向ESRD進展和預防移植后原發(fā)病再發(fā)有重要意義。
　　 國內(nèi)尚無大樣本資料研究HLA與ESRD的相關(guān)性。本課題以等候腎移植的終末期腎功能衰竭患者、正常健康人群為研究對象,采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction sequence specific primer,PCR-

8、SSP)技術(shù)檢測終末期腎功能衰竭患者HLA-A,B,DRB1基因分型及單倍型多態(tài)性,與健康人群進行比較,探討HLA在因各類腎臟病導致患者最終并發(fā)終末期腎功能衰竭進程中的免疫遺傳易感性。
　　 第一章終末期腎功能衰竭患者HLA基因多態(tài)性分析
　　 目的:通過對等候腎臟移植的患者進行HLA-A,B,DRB1基因表達的研究,與健康對照組相比較,以探討在因腎臟疾病導致患者最終并發(fā)終末期腎功能衰竭(End-stage renal

9、disease,ESRD)進程中的HLA免疫遺傳易感性及其相對風險作用。
　　 方法:對3911例終末期腎功能衰竭患者(病例組)和4707例無血緣關(guān)系隨機健康獻血者(對照組)采用PCR-SSP方法檢測兩組HLA-A,B,DRB1三個座位的基因分型。應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析數(shù)據(jù),HLA基因表現(xiàn)型頻率(phenotype frequencies,PF)=觀察到的HLA基因陽性個數(shù)(n)/被研究人數(shù),基因頻率(gene f

10、requencies,GF)應用公式GF=1-(1-PF)1/2計算。兩組基因表現(xiàn)型頻率、基因型頻率的比較采用四格表x2檢驗。兩組比較的OR值通過Woolf公式計算。對P值計算其校正Pc值(以P值乘以所檢測的某一位點的抗原數(shù)即Pc值表示)。由于我們比較的抗原數(shù)較多,容易造成統(tǒng)計學上的Ⅰ類誤差,即有可能完全由于機會而表現(xiàn)出HLA基因與ESRD有統(tǒng)計學意義的關(guān)聯(lián),故需校正P值,即P值乘以被比較的抗原數(shù),有時校正后仍會出現(xiàn)Ⅰ類誤差,給合相關(guān)文

11、獻,我們將Pc值設定為<1×10-5具有統(tǒng)計學差異,所有統(tǒng)計計算均由SPSS13.0完成。
　　 結(jié)果:1、ESRD患者組檢出HLA-A位點基因19個,對照組檢出17個。ESRD患者組比對照組多檢出的基因為A*25和A*80。在ESRD患者組中HLA表型頻率顯著降低的是HLA—A*30(Pc<0.00001),未發(fā)現(xiàn)頻率顯著升高的基因。
　　 2、ESRD患者組檢出HLA-B位點基因41個,對照組檢出38個,僅在ESRD

12、患者組中檢出的基因為HLA-B*28、B*42、B*72、B*78和B*73,僅在對照組中檢出的基因為HLA-B*47和B*64。在ESRD患者組中表型頻率顯著升高的基因為HLA-B*75(Pc<0.00001,OR=1.479,95％CI=1.315-1.664),未發(fā)現(xiàn)頻率顯著降低的基因。
　　 3、ESRD患者檢出HLA-DRB1位點基因14個,對照組檢出13個。ESRD患者組比對照組多檢出的基因為HLA-DR*18。在E

13、SRD患者組表型頻率顯著升高的基因為HLA-DR*04(Pc<0.00001,OR=1.294,95％CI=1.172-1.428)、HLA-DR*17(Pc<0.00001,OR=2.639,95％CI=2.240-3.110),顯著降低的基因為HLA-DR*08(Pc<0.00001,OR=0.697,95％CI=0.615-0.791)。
　　 結(jié)論：1.HLA在不同地區(qū),不同種族表現(xiàn)出與ESRD相關(guān)聯(lián)的易感基因和保護基因

14、不同。
　　 2.HLA-A*30雖然在病例組和對照組表型頻率比較中具有統(tǒng)計學差異,但其在兩組中的頻率均較低,結(jié)合臨床,認為其不與ESRD存在關(guān)聯(lián)。
　　 3.HLA-B*75、DR*04和DR*17可能對我國南方漢族腎臟疾病患者最終并發(fā)ESRD具有獨立易感關(guān)聯(lián),而表達HLA-DR8的腎臟病患者將可能延緩發(fā)生ESRD。
　　 4.我國南方漢族腎臟病患者可能并發(fā)ESRD的易感基因和保護基因的發(fā)現(xiàn)對于本地區(qū)等候腎臟移

15、植患者選擇合適供體,提高移植后患者生存時間和遠期移植效果具有臨床指導意義。
　　 第二章HLA易感基因相應單倍型與ESRD易感關(guān)聯(lián)分析
　　 目的：通過多中心大樣本等待腎移植受者的HLA分型資料與健康人群對照分析,發(fā)現(xiàn)HLA-B*75,DR*04,DR*17是終末期腎功能衰竭(End-stage renaldisease)的易感基因,在此基礎上分析與其相關(guān)單倍型在病例組和對照組的分布,探討與終末期腎功能衰竭存在易感關(guān)聯(lián)的

16、HLA單倍型。
　　 方法：應用人口遺傳學軟件Arlequin統(tǒng)計分析ESRD患者組和對照組HLA兩位點單倍型頻率,通過卡方檢驗篩選病例組具有統(tǒng)計學差異的單倍型,計算其優(yōu)勢比(odds ratio,OR)。對P值計算其校正Pc值(以P值乘以HLA每兩位點所檢出的單倍型數(shù)即Pc值表示)。
　　 結(jié)果：1.ESRD患者組表達HLA易感基因B*75-A位點單倍型11條,對照組患者組表達HLA易感基因B*75-A位點單倍型7條。

17、僅在ESRD患者組中表達的單倍型為A*33-B*75,A*66-B*75,A*03-B*75,A*29-B*75,A*34-B*75,A*68-B*75(頻率分別為0.268％,0.051％,0.049％,0.046％,0.037％,0.022％)。僅在對照組表達的單倍型為A*30-B*75,A*25-B*75(頻率分別為0.057％,0.040％)。兩組對比,單倍型頻率未發(fā)現(xiàn)有顯著差異。
　　 2、ESRD患者組表達HLA易感

18、基因DR*04-B位點單倍型27條,僅在ESRD患者組中表達的單倍型為B*44-DR*04,B*37-DR*04,B*57-DR*04,B*81-DR*04,B*28-DR*04(頻率為0.166％,0.111％,0.061％,0.051％,0.013％)。對照組表達HLA易感基因DR*04-B位點單倍型25條,僅在對照組表達的單倍型為B*63-DR*04,B*49-DR*04,B*42-DR*04(頻率均為0.040％)。兩組對比,E

19、SRD患者組中單倍型頻率顯著升高(Pc<0.05)的是B*13-DR*04(1.149％vs0.043％),B*46-DR*04(1.952％ vs0.758％),B*58-DR*04(0.957％vs0.138％),B*75-DR*04(1.354％vs0.450％)。
　　 3、ESRD患者組表達HLA易感基因DR*17-B位點單倍型31條。對照組表達HLA易感基因DR*17-B位點單倍型16條。ESRD患者組比對照組多表達

20、的單倍型為B*13-DR*17,B*62-DR*17,B*39-DR*17,B*61-DR*17,B*48-DR*17,B*56-DR*17,B*07-DR*17,B*45-DR*17,B*76-DR*17,B*18-DR*17,B*77-DR*17,B*72-DR*17,B*78-DR*17,B*63-DR*17,B*42-DR*17。兩組對比,在ESRD患者組中未發(fā)現(xiàn)頻率顯著升高的單倍型。
　　 結(jié)論：
　　 1.H