綿羊肺炎支原體(Y-98標(biāo)準(zhǔn)株)P30基因真核表達(dá)載體構(gòu)建與P30-IFNγ融合蛋白疫苗研制.pdf

1、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma oumvipneonia,MO)是綿羊養(yǎng)殖過程中的常見病原菌,可以引發(fā)綿羊支原體腫炎。該病流行范圍廣,發(fā)病期長,給養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本文選擇P30外膜蛋白為抗原蛋白,同時(shí)以細(xì)胞因子IFNγ為疫苗佐劑,將兩者串聯(lián)融合表達(dá)。以綿羊肺炎支原體(MO)標(biāo)準(zhǔn)株Y98基因組為模板,設(shè)計(jì)一對特異性引物,PCR擴(kuò)增得到795bp的P30目的基因,與文獻(xiàn)報(bào)道的P30基因序列一致;提取小鼠總RNA

2、,設(shè)計(jì)特異性引物,通過RT-PCR擴(kuò)增IFNγ目的基因。將兩者定向克隆到原核表達(dá)載體pET-22b(+)中,得到pET-P30、pET-IFNγ和pET-P30-IFNγ重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)。重組菌株分別命名為BL21(DE3)(pET-P30)、BL21(DE3)(pET-IFNγ)和BL21(DE3)(pET-P30-IFNγ)。由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析,得到3

3、0.0KD、20.1KD和47.2KD的特異條帶,與預(yù)期的P30外膜蛋白、IFNγ以及P30-IFNγ融合蛋白大小一致,且均具有良好的反應(yīng)原性。
　　對3種重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化得到可溶性目的蛋白,制備P30基因工程疫苗、IFNγ佐劑疫苗以及P30-IFNγ融合蛋白疫苗。小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,P30基因工程疫苗的免疫保護(hù)率為60％,IFNγ佐劑疫苗的免疫保護(hù)率為20％,P30-IFNγ融合蛋白疫苗的免疫保護(hù)率達(dá)到80％。間

4、接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí),經(jīng)100μL與200μL劑量P30-IFNγ融合蛋白疫苗免疫的小鼠血清中,P30抗體效價(jià)分別為1:32000與1:64000。經(jīng)IFNγ佐劑疫苗免疫的小鼠血清中,未檢測出陽性P30抗體效價(jià)。以上結(jié)果證實(shí),所制備的疫苗安全有效,且融合蛋白疫苗中的細(xì)胞因子IFNγ組分可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能,增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)效果。
　　結(jié)合近年來疫苗研制領(lǐng)域的發(fā)展動(dòng)念,本研究還對轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研制進(jìn)行了探究。設(shè)計(jì)特異性引物,擴(kuò)增

5、了P30目的基因,將其定向克隆到含黃色熒光蛋白(yellowfluorescent protein,YFP)標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pCAMBIA1300-YFP中,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1300-P30-YFP并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium)感受念細(xì)胞,侵染煙草(tobacco)葉片。通過激光共聚焦成像顯微鏡(cofocal imaging microscope)觀察到融合表達(dá)的黃色熒光蛋白P30-YFP,Western