TCDCA對佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，伴隨著復(fù)雜的炎癥介質(zhì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)的損害、滑膜炎癥、軟骨和骨的損壞，導(dǎo)致人類和動物嚴(yán)重的機(jī)體功能障礙。盡管RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但其主要的病理過程環(huán)節(jié)基本清楚，即免疫功能失調(diào)、關(guān)節(jié)滑膜組織增殖增厚、軟骨與骨破壞等三個方面。目前尚缺乏真正有效而副作用小的治療藥物，因此，尋找作用顯著、副作用小的天然活性成分逐漸成為RA藥物的研究熱點(diǎn)。
　　

2、牛磺鵝去氧膽酸（Taurochenodeoxycholic Acid，TCDCA）是動物膽汁酸中具有生物活性的主要有效成分之一，從動物膽汁酸中分離提取純化的TCDCA對動物機(jī)體的急、慢性炎癥均有顯著的抑制作用；對機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫和吞噬功能均有顯著的調(diào)節(jié)作用。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠為對象，觀察了具有較高抗炎免疫調(diào)節(jié)活性的TCDCA的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用，同時從影響

3、AA模型發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活性方面探討了其治療 AA模型可能的藥理作用機(jī)制，為將其開發(fā)為治療RA的新藥奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本課題的主要研究內(nèi)容包括以下五個方面：
　?。?）AA模型大鼠的建立與評價
　　通過比較常用關(guān)節(jié)炎動物模型的誘導(dǎo)方法，本研究優(yōu)化篩選出了高成功率、臨床癥狀典型、穩(wěn)定的誘導(dǎo)AA模型的方法。通過關(guān)節(jié)炎動物模型的評價標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)建立的AA模型大鼠，造模15d時模型大鼠的對側(cè)

4、腳踝關(guān)節(jié)、足跖部出現(xiàn)明顯的腫脹、四肢爪子表面出現(xiàn)紅斑、尾根明顯腫脹結(jié)節(jié)，對側(cè)腳的腫脹率達(dá)到25.15％，隨著時間的延長對側(cè)腳踝關(guān)節(jié)、足跖部腫脹率不斷增大；造模30d時大鼠的四肢嚴(yán)重腫脹、尾巴出現(xiàn)明顯結(jié)節(jié)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)達(dá)到14.25，對側(cè)腳的腫脹率達(dá)到48.09%，X-ray拍片顯示骨骼之間界限模糊，骨密度降低，踝關(guān)節(jié)部和趾部軟組織明顯增厚。通過3次重復(fù)試驗(yàn)顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的AA模型較為穩(wěn)定，成功率均在80%以上。
　?。?）TCDC

5、A對AA模型大鼠的治療作用
　　AA模型大鼠連續(xù)灌胃給藥高低劑量TCDCA（0.2g/kg.b.w、0.1g/kg.b.w）14d后，根據(jù)模型評價標(biāo)準(zhǔn)對給藥前后的關(guān)節(jié)炎動物模型進(jìn)行了評價。結(jié)果：模型大鼠銳減的體重得到顯著性的恢復(fù)，增重率分別由25.57%提高到44.41%、46.02%；模型大鼠四肢及尾根呈現(xiàn)的紅斑、腫脹得到一定程度的緩解，關(guān)節(jié)炎指數(shù)分別由13.38降為10.44、10.03；模型大鼠對側(cè)腳腫脹率分別由50.17%

6、降為47.96%、45.83%。通過X-ray觀察，模型大鼠兩后肢踝關(guān)節(jié)和趾部骨骼的明顯腫大，趾部各骨骼之間界限模糊，骨密度降低，踝關(guān)節(jié)部和趾部的軟組織明顯增厚等特征均得到一定程度的減輕。以上結(jié)果顯示TCDCA對AA模型大鼠呈現(xiàn)出良好的治療作用。
　?。?）TCDCA對AA模型大鼠體內(nèi)關(guān)鍵細(xì)胞因子的影響
　　通過ELISA法和RT-PCR技術(shù)分別檢測了AA模型大鼠血清和滑膜組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL

7、-10蛋白和mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果，分別灌胃給藥 AA模型大鼠高低劑量 TCDCA（0.2g/kg.b.w,0.1g/kg.b.w）14d和31d后，TCDCA可顯著的抑制AA大鼠血清中過度分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白和滑膜組織中mRNA水平的表達(dá)(P<0.05)；高劑量（0.2g/kg.b.w）TCDCA連續(xù)給藥31d后可顯著的提高模型大鼠血清中IL-10的含量和滑膜組織mRNA水平的表達(dá)量(P<0.05)。
　

8、　（4）TCDCA對 AA模型大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）和腹腔巨噬細(xì)胞（PMΦ）中關(guān)鍵細(xì)胞因子的影響
　　采用組織塊培養(yǎng)法獲得形態(tài)典型、單一的FLS細(xì)胞。采用ELISA法檢測了AA模型大鼠FLS細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白的含量，同時采用RT-PCR法測定了相應(yīng)細(xì)胞因子 mRNA水平表達(dá)的變化。結(jié)果：TCDCA（300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL）均可顯著的抑制 AA模

9、型 FLS細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的含量(P<0.05)，而對IL-10蛋白則無顯著性的影響（P>0.05）；TCDCA（300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL）可顯著抑制FLS細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表達(dá)量(P<0.05)，TCDCA（500μg/mL）顯著上調(diào)IL-10基因的表達(dá)量(P<0.05)。
　　采用PBS腹腔灌洗法獲得高純度的PMΦ細(xì)胞；采用ELISA法測定了

10、 AA大鼠PMΦ細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10蛋白的含量；采用RT-PCR技術(shù)檢測了相應(yīng)細(xì)胞因子 mRNA水平表達(dá)的變化。結(jié)果：TCDCA（150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL）可劑量依賴性的顯著抑制 AA模型 PMΦ細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的含量(P<0.05)，TCDCA（150μg/mL、180μg/mL）顯著提高IL-10蛋白的含量(P<0.05)。TCD

11、CA（150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL）可劑量依賴性的顯著抑制AA模型PMΦ細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6基因的表達(dá)量(P<0.05)，而對IL-10基因的表達(dá)量則無顯著性的影響（P>0.05）。
　?。?）TCDCA對AA模型大鼠FLS和PMΦ中NF-κB活性表達(dá)的影響
　　通過ELISA法和Western-blot法分別檢測了FLS和PMΦ細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白和細(xì)胞內(nèi) IκBα蛋白的

12、表達(dá)量。結(jié)果：TCDCA（300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL）對FLS細(xì)胞中活化的NF-κB p65蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，并顯著的提高細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白的表達(dá)和抑制磷酸化IκBα蛋白的表達(dá)；TCDCA（150μg/mL、180μg/mL、200μg/mL）對PMΦ細(xì)胞中活化的NF-κB p65蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，并顯著性提高細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白的表達(dá)和TCDCA（200μg/mL）顯著抑