麥冬多糖單次靜脈注射給藥后在大鼠體內(nèi)的組織分布研究

1、<p>　　麥冬多糖單次靜脈注射給藥后在大鼠體內(nèi)的組織分布研究

2、 </p><p>　　盧智玲1, 林曉1 , 馮怡1 , 徐德生2*（1 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203 ； 2

3、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海200021）</p><p>　　摘要：目的 建立柱前熒光衍生－高效凝膠色譜法測定大鼠組織樣品中麥冬多糖，并研究其在大鼠體內(nèi)的分布特點和規(guī)律。方法SD大鼠單次靜脈注射麥冬多糖50mg/kg后在5min,10min,30min,60min取各組織，用HPGPC法測定藥物濃度。結(jié)果 絕大多數(shù)容易聚集在腎臟，并以尿的形式排泄，其他組織中含藥量分布順序從高到低依次為：肺，胃，心，脾，肝，

4、腦。結(jié)論 結(jié)合前期麥冬多糖的離體藥效實驗及心肌細(xì)胞藥效實驗均表現(xiàn)顯著抗心肌缺血作用的結(jié)論，本實驗則從藥物能在心臟有一定分布的藥動學(xué)角度，進(jìn)一步證明了麥冬多糖可能是直接作用于靶器官并發(fā)揮其抗心肌缺血的作用。</p><p>　　關(guān)鍵詞: 麥冬多糖；柱前熒光衍生－高效凝膠色譜法；組織分布；抗心肌缺血</p><p>　　Tissue Distribution of Polysaccharid

5、e MDG-1 after Single Intravenous Dose in Rats </p><p>　　LU Zhi-ling1 , LIN Xiao1 , FENG Yi1 , XU De-sheng2* (1 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai, 201203, China;2 Shuguang Affiliat

6、ed Hospital of Shanghai University of TCM, Shanghai, 200021, China)</p><p>　　ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the tissue distribution of Polysaccharide MDG-1 in rats with the precolumn FITC labeled–HPGPC

7、method. METHODS Various tissues were obtained at 5min,10min,30min and 60min after single intravenous administration of Polysaccharide MDG-1 with the dose of 50mg/kg.The concentration of MDG-1 in the samples were subsequ

8、ently determined by HPGPC.RESULTS Most MDG-1 is readily accumulated in the kidneys and excreted in urine. The distribution sequence of different body</p><p>　　KEY WORDS: Polysaccharide MDG-1；precolumn FITC

9、labeled–HPGPC method；tissue distribution；antimyocardial ischemic activity</p><p>　　目前，國內(nèi)外有關(guān)多糖給藥后在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程的報道相對較少，僅有數(shù)十篇，如六味地黃多糖[1]，銀耳多糖[2]，右旋糖苷[3]，云芝多糖[4]等。究其原因，主要是因為多糖自身無光學(xué)功能團(tuán)，分子量在一定范圍內(nèi)變化等特點，使糖

10、類在生物體內(nèi)的含量測定比較困難。本課題組經(jīng)多年的前期研究積累，麥冬多糖注射液的新藥研究已取得階段性成果。實驗前期已成功建立了靈敏度高，專屬性強(qiáng)的柱前熒光衍生－高效凝膠色譜法，用于分析多糖跨細(xì)胞膜樣品[5]。在此基礎(chǔ)上，完全能利用該微量分析方法對麥冬多糖靜注給藥后的各個組織分布情況進(jìn)行研究，探討藥物在體內(nèi)的分布特征，一方面為麥冬多糖</p><p>　　作者簡介：盧智玲（1977-），女，博士研究生，主要從事中藥制

11、劑及藥動學(xué)研究。</p><p>　　*通訊作者：徐德生，男，博導(dǎo) 聯(lián)系電話：（021）51322491，E-mail:luzhiling0212@126.com</p><p>　　注射液的藥學(xué)研究提供進(jìn)一步的資料，另一方面也可從藥物在靶器官的分布情況來探討其抗心肌缺血的可能作用機(jī)理。</p><p><b>　　1 材料</b></

12、p><p>　　1.1 藥品與試劑 </p><p>　　異硫氰酸熒光素衍生多糖MDG-1（FITC-MDG-1）(自制，批號為060621)，三氯乙酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉（分析純，上海試劑四廠），磷酸二氫鈉（分析純，上海新華化工廠），磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），三蒸水（實驗室自制）。</p><p><b>

13、　　1.2 主要儀器</b></p><p>　　LC-20AB高效液相色譜儀（日本Shimadzu）；RF-10AXL熒光檢測器； 5417R高速冷凍離心機(jī)（德國，Eppendorf）；F6/10超細(xì)勻漿器（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；QL-9010旋渦混合器（江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；電子天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司）。</p><p><b>

14、　　1.3 實驗動物</b></p><p>　　SD大鼠，雄性，250±50g，上海中醫(yī)藥大學(xué)動物試驗中心提供。</p><p><b>　　2 方法</b></p><p>　　2.1 組織樣品高效凝膠色譜分析方法的建立</p><p>　　2.1.1 色譜條件</p>&l

15、t;p>　　色譜柱：Shodex Sugar ks-802（日本昭和電工）；流動相：0.1M NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（PH 7.0）流速：0.5mL/min；熒光檢測波長：激發(fā)波長ex 495nm，發(fā)射波長em 515 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20ul</p><p>　　2.1.2 組織樣品的預(yù)處理[6]</p><p>　　取各組織樣品（腦，心，肝，脾，肺，腎，

16、胃）約0.5g，加入3倍體積的0.1M PH7.0磷酸鹽緩沖液，制備勻漿。將80ul30％（w/v）三氯乙酸加入于200ul25％（w/v）的組織勻漿液中，混合物渦旋，并以10000rpm的速度離心10min，取100ul上清加15ul 11％（w/v）NaoH以中和，并加入流動相85ul，稀釋使成200ul，再以10000rpm轉(zhuǎn)速離心10min后，取上清注入HPLC色譜儀。</p><p>　　2.1.3 方

17、法專屬性考察</p><p>　　取大鼠空白組織，按組織樣品預(yù)處理項下方法處理并分析，獲得空白樣品的色譜圖；將空白組織勻漿液加一定濃度的FITC-MDG-1溶液，同法操作后，獲得相應(yīng)的色譜圖。</p><p>　　2.1.4 組織樣品標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備</p><p>　　精密稱取FITC-MDG-1適量，以PH7.0磷酸鹽緩沖液為介質(zhì)，配成質(zhì)量濃度為0.55mg/

18、ml的儲備液，備用。然后取母液逐步稀釋，得到質(zhì)量濃度為2.75、5.5、11、27.5、55、110、220ug/ml的FITC-MDG-1對照品溶液。</p><p>　　分別取上述系列對照品溶液20ul,加入到200ul各組織空白勻漿液中，配成各組織相應(yīng)線性范圍內(nèi)的一系列濃度溶液，按2.1.2項下的“組織樣品預(yù)處理”方法進(jìn)行處理、進(jìn)樣。以所得的峰高H對濃度C，用加權(quán)（1/C2）最小二乘法進(jìn)行回歸運算，得到各組

19、織中FITC-MDG-1含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。</p><p>　　2.1.5 方法回收率測定</p><p>　　取大鼠空白組織勻漿液200ul，分別加入適量高、中、低濃度的對照品溶液，每種濃度5份樣品，按2.1.2項下的“組織樣品預(yù)處理”方法進(jìn)行處理，于上述色譜條件下，進(jìn)樣測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實測濃度，與理論濃度相比得到方法回收率。</p><p>　　2.1.6

20、 方法精密度測定</p><p>　　取大鼠空白組織勻漿液200ul，分別加入適量高、中、低濃度的對照品溶液，各5份。按2.1.2項下的“組織樣品預(yù)處理”依法操作后，在上述色譜條件下，于一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)行含量測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中FITC-MDG-1濃度并計算得日內(nèi)差；連續(xù)三日進(jìn)行測定，得到日間差。</p><p>　　2.2 組織分布研究</p><p>　　

21、取健康SD大鼠20只，雄性。隨機(jī)分成4組，自由進(jìn)食和飲水。以50mg/kg的劑量緩慢經(jīng)大鼠股靜脈iv給藥，4組受試大鼠分別于給藥后5min,10min,30min,60min從大鼠腹主動脈放血處死（每個時間點取5只），迅速取出腦，心，肝，脾，肺，腎，胃等組織，組織用生理鹽水沖凈表面血液及內(nèi)容物后，分別稱量各臟器濕重，裝入自封袋，置于－20℃冰箱中保存至分析測定。</p><p><b>　　3 結(jié)果&

22、lt;/b></p><p>　　3.1 組織樣品分析方法的確證</p><p>　　3.1.1 方法專屬性考察</p><p>　　以心組織樣為代表，樣品分析方法專屬性測定結(jié)果見圖1,其他組織圖譜均類似，限于篇幅，省略。結(jié)果表明，在上述色譜條件下分析，組織中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾FITC-MDG-1的測定。</p><p>　　A Bla

23、nk heart sample B FITC-MDG-1 in blank heart sample</p><p>　　圖 1 空白組織干擾圖</p><p>　　Fig 1 Chromatograms of FITC-MDG-1 in rat tissues </p><p>　　3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備</p><

24、p>　　記錄各組織樣品的峰高，以藥物濃度x為橫坐標(biāo)，峰高H為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（1/c2）最小二乘法進(jìn)行回歸計算，求得的直線回歸方程即為工作曲線方程。各組織回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。</p><p>　　表 1 各組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 </p><p>　　Tab 1 Regression equations and R of FITC-MDG-1 in different ti

25、ssues </p><p>　　3.1.3 方法精密度與回收率</p><p>　　各組織樣品的精密度與回收率結(jié)果均能滿足生物樣品測定的要求，分別見表2和表3。 </p><p>　　表2 檢測方法的精密度測定結(jié)果 (n=5)</p><p>　　Tab 2 precision of determination of FITC-MD

26、G-1 in tissues by HPGPC(n=5)</p><p>　　表3 檢測方法的回收率測定結(jié)果 (n=5)</p><p>　　Tab 3 recoveries of determination of FITC-MDG-1 in tissues by HPGPC(n=5)</p><p>　　3.2 大鼠體內(nèi)各組織臟器中藥物濃度的測定結(jié)果</p&

27、gt;<p>　　大鼠按50mg/kg劑量iv給予FITC-MDG-1后，5min,10min,30min,60min時間點的組織分布實驗結(jié)果見表4。其中腎組織樣品為稀釋5倍，使測定濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，進(jìn)行含量測定。根據(jù)不同時間組織中藥物分布繪制藥物分布柱形圖，由于腎中分布明顯遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他組織，不再將其繪制入柱形圖，便于更好比較其他各個組織的分布情況，見圖2。</p><p>　　表4 FI

28、TC-MDG-1靜脈給藥后大鼠組織分布（n=5）</p><p>　　Tab 4 Concentration of FITC-MDG-1 in different tissues at 5,10,30 and 60min after a single 50mg/kg iv dose (n=5)</p><p>　　注：n.d 表示未能檢測</p><p>　　n.

29、d means non-determinable since below the limit of determination</p><p>　　圖2 麥冬多糖在各個組織分布的柱形圖</p><p>　　Fig 2 Concentratin of MDG-1 in different tissues at different time </p><p>　　

30、3.3藥動學(xué)數(shù)據(jù)處理結(jié)果</p><p>　　根據(jù)麥冬多糖MDG-1靜脈注射后各組織臟器中的濃度繪制組織濃度－時間曲線，梯形法計算各組織中的藥物的AUC，具體結(jié)果見表5。</p><p>　　表5 大鼠各組織50mg/kg靜注后AUC值</p><p>　　Tab 5 AUC of MDG-1 in different tissues after 50mg/kg

31、iv administration</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　MDG-1靜脈注射給藥后，絕大多數(shù)容易聚集在腎臟，并以尿的形式排泄，因此腎臟分布最多。這與麥冬多糖MDG-1的峰尖分子量約5000，粒徑<2.0nm, 低于腎小球的截留值的特性是一致的。并且與文獻(xiàn)[3]中提到的低分子量葡聚糖如FD-4易分布在腎并通過尿排泄的結(jié)

32、果是相符合的。根據(jù)各組織的AUC值，其他組織中含藥量分布順序從高到低依次為：肺，胃，心，脾，肝，腦。另外，各組織中藥物濃度也和靜脈注射血藥濃度那樣，表現(xiàn)為隨時間增加，分布逐漸減少?？赡苡捎诙嗵鞘撬苄运幬?，因血腦屏障的存在，腦中分布最少，在30min時間點后，幾乎都不能檢測。由于大部分麥冬多糖因分子量較小而從腎中被清除了，我們可以下一步考慮對多糖MDG-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，通過增加其分子量使其腎清除較少，則多糖可更多地在系統(tǒng)循環(huán)，更好地起效

33、。</p><p>　　前期的麥冬多糖MDG-1的離體藥效學(xué)實驗研究結(jié)果表明，MDG-1具有明顯的拮抗缺血再灌注引起的離體心臟損傷及保護(hù)作用。同時MDG-1在培養(yǎng)心肌細(xì)胞的藥效實驗中也表明多糖對心肌缺氧細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。而從本實驗組織分布情況來分析， 心臟對MDG-1有較強(qiáng)的攝取能力，再結(jié)合以往藥效實驗結(jié)果，則可從藥物在心臟有一定分布的藥動學(xué)角度，作進(jìn)一步推斷，麥冬多糖之所以有抗心肌缺血的作用，可能是其直接

34、作用于靶器官，從而發(fā)揮藥效。</p><p>　　REFERENCES</p><p>　　[1] Zheng N X, Ruan J X, Zhang Y X, etal. Intestinal absorption of an acidic polysaccharide from Liuwei Dihuang decoction in mice[J]. Chin Pharmacolog

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36、(3):205-208.</p><p>　　[3] Mehvar R, Robinson MA, Reynolds JM. Molecular weight dependent tissue accumulation of dextrans: in vivo studies in rats[J].J Pharm Sci,1994,83(10):1495-1499.</p><p>　　[

37、4] Ikuzaea M, Matsunaga K, Nishiyama S, et al. Fate and distribution of an antitumor protein-bound polysaccharide PSK(krestin) [J].Int J Immunopharm,1988,10:415-423.</p><p>　　[5] Lu Z L, Lin X, Xu D S, etal.

38、 Study on transport mechanism of Polysaccharide MDG-1 from Ophiopogon japonicus in Caco-2 cell culture model[J].Chin JMAP(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)), 2006，23（6）：452-454.</p><p>　　[6] Kaneo Y, Uemura T, Tanaka T, etal. Polysa