鴨坦布蘇病毒巢式PCR檢測方法及其重組E蛋白間接ELISA診斷方法的研究.pdf

1、2010年4月以來，我國東南部分地區(qū)飼養(yǎng)的種鴨和蛋鴨爆發(fā)了鴨坦布蘇病毒病，以產蛋急劇下降為特點，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失，因此有必要建立一種快速、敏感、特異的診斷方法。分子生物學技術的發(fā)展為黃病毒屬病毒的快速診斷帶來了新的策略。
　　 參照GenBank已登錄的黃病毒基因序列設計黃病毒通用引物，建立了基于黃病毒通用引物的高敏感巢式PCR檢測方法，為黃病毒、特別是新發(fā)黃病毒提供了高效的檢測方法。該方法通過序列的比對，選擇NS5基因

2、保守區(qū)設計了兩對通用簡并引物FlavP1-FlavP4，在此基礎上建立了巢式PCR檢測方法，并應用到鴨坦布蘇病毒(ducktembusuvirus，DTV)的檢測中。該方法僅能擴增鴨坦布蘇病毒目的基因而不能擴增其他病毒，且敏感性達到90個拷貝·μL-1，比普通PCR高出1000倍。以上結果表明，設計的黃病毒引物具有良好的敏感性和特異性，其巢式PCR敏感性高，并成功的進行了鴨坦布蘇病毒的檢測。同源性和進化分析表明，新發(fā)黃病毒屬蚊媒黃病毒類

3、恩塔亞病毒群，與坦布蘇病毒及近期報道的鴨坦布蘇病毒分離株BYD關系最近。本研究表明該檢測方法可以用于該病的臨床診斷和流行病學調查，并闡明了鴨坦布蘇病毒的進化地位。
　　 包膜蛋白(E蛋白)是黃病毒的主要結構蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、細胞趨向性、病毒毒力和誘導保護性免疫反應中起重要作用。從規(guī)?；B(yǎng)鴨場分離到6株鴨坦布蘇病毒，并采用特異性引物成功擴增出E蛋白基因。結果表明，E基因全長1503bp，編碼501個氨基酸，序列高度保

4、守。將E基因克隆到pMD18-T載體中，經酶切鑒定和序列測定無誤后，再將該基因克隆到表達載體pET21a中，并轉化E.coli后進行誘導表達。采用原核表達系統(tǒng)對E基因進行了表達，經SDS-PAGE分析，E蛋白大小54.3kDa，主要以包涵體形式存在。Westernblot分析結果表明，表達經親和層析法純化后的蛋白能與陽性血清發(fā)生特異性反應。親和層析法從表達產物中純化目的蛋白，從而為制備鴨坦布蘇病毒實驗室診斷抗原和分析E蛋白的基因結構與功

5、能的關系奠定了基礎。
　　 中和試驗(NT)和血凝抑制試驗(HI)是目前診斷黃病毒感染的最特異方法，然而中和試驗耗時較長，費時費力。為建立快速檢測鴨坦布蘇病毒的血清學方法，以純化的表達產物作為包被抗原，初步建立了針對E蛋白抗體的間接ELISA檢測方法。對ELISA各種反應條件進行了摸索，確定了最適工作條件。優(yōu)化后確定的抗原最適包被濃度為7μg/mL，血清的最佳稀釋度為1:320,酶標抗體最適稀釋度為1:1000。在優(yōu)化條件下，陰