坦布蘇病毒的分離鑒定重組腺病毒介導shRNA抑制坦布蘇病毒在體外復制的研究.pdf

1、坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）是導致肉鴨神經(jīng)癥狀及產(chǎn)蛋鴨出血性卵巢炎（duck hemorrhagic ovaritis，DHO）的主要病原，主要引起20日齡以內的雛鴨出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)癥狀，死淘率增高及產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋大幅下降。發(fā)病雛鴨通常表現(xiàn)為采食量下降，腹瀉，共濟失調，癱瘓等癥狀。發(fā)病蛋鴨體溫升高;四肢無力、癱瘓;食欲廢絕;發(fā)病后不久開始產(chǎn)蛋大幅下降;發(fā)病后期排草綠色稀便，氣味惡臭，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。剖檢可見卵泡破裂出血，

2、卵黃性腹膜炎，脾臟出血，胰腺出血壞死，肝臟腫大、出血。
　　 TMUV屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，通過節(jié)肢動物的叮咬進行傳播而導致宿主發(fā)病。病毒的基因組全長約為11kb，包含5'和3'的非編碼區(qū)，僅含有一個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼3種結構蛋白和8種非結構蛋白。其中包膜蛋白(Envelop protein，E)蛋白是病毒的主要結構蛋白，與

3、病毒的吸附，融合，注入，血凝性及宿主范圍和細胞嗜性有密切關系;NS5蛋白為TMUV分子量最大的蛋白，也是最保守的蛋白，它具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，與病毒基因組的復制密切相關。在本研究中我們利用建立的多種TMUV核酸檢測方法應來確定TMUV感染的宿主范圍，以闡明該疾病的流行特點。并利用腺病毒介導shRNA技術靶向干擾E基因和NS5基因，探索TMUV防治的新策略，為我國有效防治該病奠定基礎。
　　 1.TMUV的半套式RT-

4、PCR檢測方法的建立
　　 根據(jù)與TMUV同源性較高的Bagaza病毒的NS3基因的保守序列設計了3條引物，建立了一種適用于TMUV檢測的半套式RT-PCR快速檢測方法。采用該方法對TMUV山東分離株進行檢測。結果顯示，半套式RT-PCR對兩株分離株均能擴增出277bp的特異性條帶，而對照病原:鴨瘟病毒、禽流感病毒(H9亞型)、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、減蛋綜合癥病毒、擴增結果均為陰性;敏感性試驗結果顯示第一輪擴增的敏感度

5、1×105copies/μL，第二輪擴增的敏感度為1×102copies/μL，第二次擴增的敏感性比第一次高103倍;該方法對山東省各地采集的24份疑似病料的檢測出率可達87.5％。表明本試驗所建立的套式PCR方法可用于TMUV感染的臨床診斷和流行病學調查。
　　 2.TMUV的RT-LAMP檢測方法的建立及四種核酸檢測方的比較
　　 根據(jù)TMUV的NS5基因的保守序列設計一套引物，建立了一種適用于TMUV的逆轉錄環(huán)介導

6、等溫擴增快速檢測方法。該方法檢測的敏感性可達1×101拷貝/μL;對3株 TMUV山東分離株的檢測均為陽性，而對鴨瘟病毒、禽流感病毒（H9亞型）、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、減蛋綜合征病毒、擴增結果均為陰性;應用該方法對山東省各地采集的76份疑似病料可檢出68份陽性。表明本試驗所建立的環(huán)介導等溫擴增檢測方法簡便、快速、靈敏、特異性高，可用于TMUV感染的臨床診斷和流行病學調查。
　　 利用針對TMUV的NS5基因建立的RT-

7、PCR，半套式RT-PCR，熒光定量RT-PCR及RT-LAMP四種檢測方法對系列稀釋的質粒DNA以及TMUV基因組RNA進行檢測，評價4種檢測方法的檢測敏感度。結果顯示四種檢測方法的質粒檢測敏感度分別為2×104拷貝/μL，20拷貝/μL，2拷貝/μL和20拷貝/μL，基因組RNA的檢測敏感度分別為100pg，100fg，10fg和100fg。在針對采自疑似TMUV感染的鴨場的69份泄殖腔棉拭子的檢測中，四種檢測方法的檢出率分別為38

8、/69(55.1％)，52/69(75.4％)，57/69(82.6％)和55/69(79.7％)。綜上所述，四中核酸檢測方法中RT-LAMP以其在敏感度，特異性及檢測時間等方面的優(yōu)勢，作為TMUV檢測中的首選檢測方法。
　　 3.不同宿主來源的TMUV的分離鑒定
　　 為研究TMUV的自然感染宿主范圍及流行特點，我們從山東省各地采集麻雀樣品68份，蚊子樣品35組，蛋雞樣品73份，蛋鴨樣品132份和雛鴨樣品112份，應用

9、建立的半套式RT-PCR進行TMUV的檢測，并對陽性樣品進行分離鑒定。結果顯示5種樣品的檢出率分別為66％(45/68)，60％(21/35)，33％(24/73)，62％(82/132)和69％(77/112)。對每類樣品選取一株分離株進行NS5基因的序列分析，結果5株分離株的NS5基因同源性高達99.5％以上。代表毒株TMUV-SDHS與經(jīng)典毒株YY5，BYD的相應基因的同源性在99％以上，與TMUV國外分離株的同源性在87％-91

10、％之間。攻毒試驗顯示TMUV-SDHS及TMUV-SDMS可以引起55周齡的櫻桃谷鴨種鴨發(fā)病且臨床癥狀與剖檢變化與自然感染病例一致。以上結果表明山東省TMUV感染現(xiàn)象已經(jīng)十分普遍;山東省不同宿主來源的TMUV分離毒株為同一種病毒;TMUV不僅可以感染產(chǎn)蛋鴨及雛鴨也可以感染蛋雞和麻雀，但無明顯癥狀;麻雀及蚊子可攜帶TMUV并與TMUV在自然界中的傳播有著密切的關系;麻雀攜帶TMUV與該病毒在冬季仍然流行有著密切關系。
　　 4.T

11、MUV山東分離株全基因序列的測定及分析
　　 從山東濰坊發(fā)生產(chǎn)蛋下降的鴨群中分離到一株TMUV(SD1001)，應用RT-PCR及RACE技術對該分離株的全基因序列進行測定并對獲得的序列進行分析。結果顯示該TMUV分離株為單股正鏈RNA病毒，基因組全長10990nt，僅含有一個獨立的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼3410個氨基酸?；蚪M兩端分別為5'和3'非編碼區(qū)，長度分別為142nt和618n

12、t。病毒基因組共編碼11種蛋白，其中3種結構蛋白，8種非結構蛋白。通過將各編碼蛋白的氨基酸序列與JEV、WNV、YFV、DEN2V、BAGV、TBEV的相應序列進行比較，結果TMUV與BAGV的氨基酸同源性最高(81.4％)，與TBEV的同源性最低(41.8％)。同時TUMV的非編碼區(qū)序列與BAGV具有高度的一致性，包含多個保守區(qū)域(conserved sequences，CS)，CS序列為RCS3-CS3-RCS2-CS2-CS1。以

13、上研究結果為研究病毒宿主特點及組織嗜性提供了有力的數(shù)據(jù)支持。
　　 5.腺病毒介導shRNA在體內外抑制TMUV復制研究.
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)，又稱RNA沉默，是指雙鏈RNA特異性誘導mRNA降解的過程，是一種轉錄后基因表達沉默(post transcripitional gene silence，PTGS)現(xiàn)象。近年來RNAi在疾病治療領域展現(xiàn)出極大的潛力，特別是抗病毒治療等

14、方面。
　　 (1)靶向干擾TMUV E基因和NS5基因shRNA序列的篩選
　　 本研究針對TMUV的E和NS5基因分別設計構建了三個特異性shRNA(short hairpinRNAs)表達載體pSilencer-E1、pSilencer-E2、pSilencer-E3及pSilencer-NS51、pSilencer-NS52、pSilencer-NS53。用RT-PCR擴增TMUV的E、NS5部分基因，純化后將二

15、者分別克隆到pEGFP-N1載體中，構建熒光報告重組質粒pEGFP-E和pEGFP-NS5。干擾載體和目的基因報告載體共轉染293T細胞后的檢測結果表明，6個干擾載體均不同程度的干擾了目的基因的表達，其中pSilencer-E1及pSilencer-NS52的抑制效果最佳，分別為75.8％和68.7％。將六種的shRNA表達載體分別轉染293T細胞，轉染24h后接種TMUV病毒，接種后48h應用相對定量熒光RT-PCR上述試驗中病毒RN

16、A的相對數(shù)量。結果顯示兩種干擾載體都能有效干擾病毒在細胞中的復制，抑制效率分別為74％及86％，因此選擇pSilencer-NS52用于進一步研究。
　　 (2)干擾TMUV復制的重組腺病毒的構建與鑒定
　　 表達shRNA-NS52的腺病毒載體的構建采用AdMax載體系統(tǒng)，將shRNA-NS52表達盒從pSilencer-NS52轉移到腺病毒穿梭載體pDC312上，構建重組穿梭載體pDC312-NS52。將腺病毒骨架質

17、粒pBHGloxΔE1與pDC312-NS52穿梭質粒按1∶3比例共轉染HEK293細胞，進行同源重組，成功產(chǎn)生重組腺病毒pAd-NS52并通過HEK293細胞多次擴增后測定重組病毒滴度分別為2.1×109pFU/ml.
　　 (3)重組腺病毒介導的shRNA抑制TMUV在HEK293細胞中復制的研究
　　 為評價重組腺病毒pAd-NS52對TMUV的體外干擾效果。將重組病毒pAd-NS52接種HEK293細胞，24h后