產(chǎn)氣莢膜梭菌plc和NetB基因的表達(dá)及單克隆抗體制備與鑒定.pdf

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens，C.perfringens)是一種重要的人獸共患病病原體，廣泛分布于自然界，導(dǎo)致多種動物發(fā)生壞死性腸炎、腸毒血癥，以及人類的氣性壞疽和食物中毒。產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的多種毒素在其引發(fā)的疾病中具有重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)對所有產(chǎn)氣莢膜梭菌均能分泌的α[毒素與另一種新型毒素NetB毒素進(jìn)行原核表達(dá)，通過PCR方法分別擴(kuò)增編碼α毒素去除信號肽后的plc基因片段和去除信號肽的Ne

2、tB基因片段，利用原核表達(dá)載體pGEX-6P-1構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-plc和pGEX-NetB，經(jīng)雙酶切鑒定和序列測定后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，當(dāng)1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h時重組蛋白表達(dá)量最高，并且主要以包涵體的形式存在，兩個重組蛋白的相對分子質(zhì)量分別為66 kDa和62 kDa。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后作為免疫原制備單克隆抗體。
　　 將純化蛋白pGE

3、X-plc和pGEX-NetB免疫BALB/c小鼠，加強(qiáng)免疫3d后取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選和亞克隆后獲得9株分泌抗plc單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(分別命名為H8C11、F4D9、F4C3、H11H12、F4G12、H8F8、A10H9、A10E5和G7H8)和5株分泌抗NetB單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(分別命名為D6H8、F9G3、E7G2、E11C11和E7B11)。經(jīng)Ig亞類鑒定試劑盒檢測

4、，表明A10E5和A10H9屬于IgG2a，D6H8屬于IgG2b，其余均屬于IgG1。Western blot結(jié)果表明所有單克隆抗體均與相應(yīng)的融合蛋白反應(yīng)并出現(xiàn)特異性條帶，其中A10H9和A10E5能夠識別產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的α毒素。制備的H8C11、F4D9、F4C3、D6H8、F9G3和E7G2腹水經(jīng)辛酸.飽和硫酸銨法純化后可見清晰的IgG的重鏈和輕鏈，分子量大小分別約為58 kDa和26 kDa。經(jīng)間接ELISA方法檢測，腹水中單