家蠶馬氏管響應(yīng)BmNPV感染相關(guān)miRNA的初步研究.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目模式昆蟲,其免疫防御機(jī)制是研究熱點(diǎn)。昆蟲馬氏管是一種自主免疫組織,能夠完全不依賴于脂肪體而啟動(dòng)有效免疫應(yīng)答。本課題組已在蛋白質(zhì)水平上初步證實(shí)家蠶馬氏管具有免疫調(diào)控功能。近年研究表明miRNA在生物體抗病毒感染方面發(fā)揮重要作用。本文對(duì)家蠶馬氏管響應(yīng)BmNPV病毒感染后在miRNA水平上進(jìn)行探索研究,獲得以下初步結(jié)果。
　　一、家蠶馬氏管組織小RNA文庫(kù)的構(gòu)建與深度測(cè)序
　　家蠶五齡起蠶感染BmNPV-EGFP,

2、注射TC-100為對(duì)照,在感染后3h、6h、12h和24h時(shí)相收集馬氏管組織,構(gòu)建了CK和NPV兩個(gè)小RNA文庫(kù),通過IlluminaSolexa高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。CK文庫(kù)和NPV文庫(kù)中測(cè)得原始小RNA序列分別為16681601條和16509994條。經(jīng)過生物信息學(xué)分析,CK文庫(kù)和NPV文庫(kù)中有效數(shù)據(jù)留存率較高(平均為76.5％),有效數(shù)據(jù)長(zhǎng)度主要分布在22bp左右,為Dicer酶剪切合成miRNA主要長(zhǎng)度分布范圍,可供進(jìn)一步

3、數(shù)據(jù)分析。序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段,合并處理后,兩個(gè)樣本共檢測(cè)到已知miRNA313個(gè)(其中254個(gè)為共有);DEGseq分析結(jié)果顯示兩者差異表達(dá)的miRNA為53個(gè);根據(jù)家蠶基因組序列預(yù)測(cè)獲得新miRNA108個(gè)。根據(jù)CK和NPV兩個(gè)文庫(kù)中miRNA測(cè)序拷貝數(shù)差異,共篩選出候選miRNA中28個(gè),其中17個(gè)已知miRNA和11個(gè)新miRNA。
　　二、家蠶馬氏管響

4、應(yīng)BmNPV感染候選miRNA的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
　　通過莖環(huán)RT-PCR方法對(duì)上述28個(gè)候選miRNA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,經(jīng)測(cè)序鑒定正確的有11個(gè)miRNA,其中4個(gè)已知miRNA(bmo_miR_375、bmo_miR_2731、bmo_miR_927、bmo_miR_7)和7個(gè)新miRNA(miR_N11、miR_N13、miR_N33、miR_N49、miR_N74、miR_N80、miR_N89)。采用RT-PCR方法對(duì)11個(gè)候選m

5、iRNA進(jìn)行了家蠶馬氏管對(duì)照組與病毒感染組混合樣品中相對(duì)表達(dá)分析,結(jié)果顯示,bmo-miR_375在感染病毒組樣品池中表達(dá)顯著高于對(duì)照組,miRN49和miRN74在對(duì)照組樣品池中表達(dá)顯著高于病毒感染組,而其他miRNA在對(duì)照組和感染組中相對(duì)表達(dá)量無明顯差異。我們從中篩選出候選bmo-miR_375做進(jìn)一步表達(dá)分析與靶標(biāo)預(yù)測(cè)。
　　三、家蠶編碼的bmo-miR_375的表達(dá)分析及其靶標(biāo)預(yù)測(cè)
　　家蠶五齡起蠶感染BmNPV-E

6、GFP,注射TC-100為對(duì)照,在感染后3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h和120h時(shí)相收集馬氏管組織,對(duì)bmo-miR_375在不同時(shí)相表達(dá)進(jìn)行半定量分析,結(jié)果顯示bmo-miR_375在對(duì)照組和病毒組中各時(shí)相均有表達(dá)。除了48h時(shí)相外,其他時(shí)相病毒感染組中bmo-miR_375的相對(duì)表達(dá)均高于對(duì)照組中各時(shí)相。尤其是在12h、24h和96h這3個(gè)時(shí)相中,bmo-miR_375在病毒感染組相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。在病毒

7、感染后3h、6h和12h和24h之間,bmo-miR_375的相對(duì)表達(dá)水平整體上呈逐漸上升趨勢(shì),然后在48h、72h呈現(xiàn)下降趨勢(shì),在96h、120h時(shí),又呈先升高后下降趨勢(shì)。bmo-miR_375在病毒感染組中12h、24h和96h升高趨勢(shì)原因,推測(cè)可能是家蠶通過編碼自身bmo-miR_375來調(diào)控BmNPV在馬氏管內(nèi)復(fù)制進(jìn)程相關(guān)基因的表達(dá),以便達(dá)到宿主抵抗病毒感染的免疫防御效應(yīng)。而bmo-miR_375在48h、72h和120h呈現(xiàn)的

8、下調(diào)趨勢(shì),可能與BmNPV以自己的某種方式調(diào)控宿主miRNA的合成,從而抑制bmo-miR_375的表達(dá),來破壞由宿主miRNA介導(dǎo)的宿主防御系統(tǒng)相關(guān)。在48h時(shí)相中,bmo-miR_375在對(duì)照組中相對(duì)表達(dá)水平較其他時(shí)相中略高,這是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn),該現(xiàn)象原因需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　利用生物信息學(xué)軟件PITA、RNAhybrid和RNA22,對(duì)bmo-miR_375在家蠶和病毒基因組中靶標(biāo)預(yù)測(cè)。bmo-miR_375在家蠶宿主內(nèi)

9、的可能的靶標(biāo)為表皮蛋白、超氣門蛋白、家蠶myb轉(zhuǎn)錄因子和30K脂蛋白前體,而其在病毒BmNPV中可能靶標(biāo)有病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子p47、桿狀病毒Y142蛋白和幾丁質(zhì)結(jié)合域2型。其中p47為病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,為RNA聚合酶亞基,參與病毒的復(fù)制過程,推測(cè)家蠶宿主馬氏管組織可能通過編碼的bmo-miR_375來直接或間接抑制病毒復(fù)制過程,從而達(dá)到響應(yīng)病毒感染的免疫效應(yīng)。
　　我們對(duì)bmo-miR_375在表皮、中腸、脂肪體、后部絲腺、氣管、精

10、巢、血淋巴、馬氏管等組織中的表達(dá)譜分析,結(jié)果顯示,bmo-miR_375在對(duì)照組中腸和血淋巴中無表達(dá),而在其他組織均有表達(dá),尤其是在后部絲腺中,bmo-miR_375的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于其他組織。而該miRNA在病毒感染組的所有組織中均有表達(dá),無論在對(duì)照組還是感染病毒組中,bmo_miR_375在家蠶后部絲腺組織中表達(dá)量都顯著高于其他組織中的表達(dá)。相比于對(duì)照組中組織,bmo-miR_375在病毒感染組后部絲腺內(nèi)表達(dá)量更高,其次是馬氏管