抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化及在對(duì)蝦養(yǎng)殖源頭食品安全控制中的應(yīng)用.pdf

1、抗菌脂肽是由枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)以及納豆菌(Bacillus natto)等為代表的芽孢桿菌產(chǎn)生的一系列脂肽類物質(zhì)(通常有 surfactin、iturin、fengycin subtilin和sublancin等),其分子通常以環(huán)脂肽的結(jié)構(gòu)存在。抗菌脂肽具有抗菌和生物表面活性劑特性,在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥、化妝品及食品、石油開(kāi)采和環(huán)境治理等領(lǐng)

2、域有重要的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景,已引起廣泛的關(guān)注。
　　液態(tài)發(fā)酵是抗菌脂肽目前發(fā)酵生產(chǎn)廣泛采用的方式,但液態(tài)發(fā)酵存在諸多缺點(diǎn),如發(fā)酵對(duì)設(shè)備的高要求,高成本,低產(chǎn)率,且提取純化發(fā)酵液中的產(chǎn)物較難;與液態(tài)發(fā)酵相比固態(tài)發(fā)酵有很多優(yōu)勢(shì),如發(fā)酵基質(zhì)主要是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的的副產(chǎn)物或廢棄物,可以降低生產(chǎn)成本;此外,降低了發(fā)酵設(shè)備要求,發(fā)酵效率和成本都大大降低;而且在生產(chǎn)中還可以避免出現(xiàn)液體發(fā)酵過(guò)程中難以解決的泡沫問(wèn)題,且提取工藝大大簡(jiǎn)化,成本低廉。然而,

3、關(guān)于抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵條件控制的研究鮮有報(bào)道,而固態(tài)發(fā)酵條件極大地影響抗菌脂肽的產(chǎn)量,因此研究固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽的工藝條件至關(guān)重要。此外,目前對(duì)抗菌脂肽固態(tài)發(fā)酵中的許多關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題和參數(shù)還不清楚,更缺乏系統(tǒng)性地描述整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)參數(shù)值的變化,從而影響了抗菌脂肽的整體發(fā)酵效率和發(fā)酵的工業(yè)化控制,最終將影響抗菌脂肽高效生產(chǎn)。因而,本研究對(duì)抗菌脂肽固體發(fā)酵發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究,為系統(tǒng)性地描述整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中各個(gè)參數(shù)值的變化,達(dá)到對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)高效控

4、制提供支撐。
　　近些年來(lái),隨著凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)養(yǎng)殖的快發(fā)展,導(dǎo)致對(duì)蝦養(yǎng)殖體系中水環(huán)境的持續(xù)惡化,致使對(duì)蝦的發(fā)病率不斷增加,目前水產(chǎn)病害防治的最主要措施之一是飼料中大量添加抗生素?？股氐拇罅渴褂脮?huì)導(dǎo)致其在對(duì)蝦體中的殘留量大大增加,不但降低了對(duì)蝦的抗病能力,形成惡性循環(huán),最后經(jīng)直接威脅對(duì)蝦產(chǎn)品的安全,對(duì)人體的健康也將造成巨大危害。同時(shí)對(duì)蝦原料的帶菌率嚴(yán)重,對(duì)食品的后續(xù)加工安全性造成威脅。因而,

5、源頭食品的安全性成為迫切解決的問(wèn)題。因此,尋求綠色、環(huán)保、高效的添加劑來(lái)替代抗生素成為提高對(duì)蝦抗病能力和改善對(duì)蝦產(chǎn)品使用安全性研究的熱點(diǎn)。在諸多的抗生素替代物中,作為一種新型的具有抗菌、免疫調(diào)節(jié)、促生長(zhǎng)、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性等特點(diǎn)的添加劑,抗菌肽在家禽、家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面均有一定的應(yīng)用。然而,由于抗菌肽的成本高、來(lái)源有限,通過(guò)基因工程獲得的抗菌肽活性不高等問(wèn)題,因而找出更為合適的抗生素替代物尤為重要。納豆菌NT-6菌株是本課題組近期分離出的

6、抗菌脂肽高產(chǎn)菌株,通過(guò)固體發(fā)酵抗菌脂肽產(chǎn)量達(dá)到10 g/(kg·發(fā)酵基質(zhì))且具有耐熱性強(qiáng)、pH適應(yīng)范圍廣、抗菌譜廣、溶解性好和安全無(wú)毒等特性,因此將抗菌脂肽作為抗生素的替代品添加到飼料中對(duì)提高對(duì)蝦抗病能力和食用安全性的研究將有廣泛的應(yīng)用前景。本論文的研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.網(wǎng)袋固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽參數(shù)的優(yōu)化
　　通過(guò)單因素試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵條件為甘蔗渣含量15％、料水比5:5、溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間48h和20目(Φ10cm

7、×40cm)。在此基礎(chǔ)上,初步確定料水比、溫度、接種量為3個(gè)主要影響因素。然后借助軟件 Design Expert8進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),找出了影響網(wǎng)袋發(fā)酵抗菌脂肽產(chǎn)量的各主要影響因數(shù)的最佳水平和它們之間的交互情況,并建立了預(yù)測(cè)模型方程。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌脂肽預(yù)測(cè)值的最大產(chǎn)量8.74 g/kg時(shí)對(duì)應(yīng)的三個(gè)主要因素取值分別為:水料比1.18、溫度29.78℃、接種量5.17%。為了測(cè)試該模型的精確性,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)條件下進(jìn)行,抗菌脂肽

8、的產(chǎn)量為8.77 g/kg,和預(yù)測(cè)值非常接近。
　　2.薄層固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽參數(shù)的優(yōu)化
　　以相對(duì)濕度、通氣量、厚度為3個(gè)主要影響因素,借助軟件 Design Expert8進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),找出了影響薄層發(fā)酵抗菌脂肽產(chǎn)量的各主要影響因素的最佳水平和它們之間的交互情況,并建立了預(yù)測(cè)模型方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌脂肽預(yù)測(cè)值的最高產(chǎn)量達(dá)到10.7552 g/kg,三個(gè)主因素取值分別為:相對(duì)濕度87.68%、通氣量12.48m3/

9、min、厚度3.11cm。
　　3.薄層固態(tài)發(fā)酵抗菌脂肽的動(dòng)力學(xué)研究
　　在抗菌脂肽薄層固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中,定時(shí)測(cè)定發(fā)酵體系中生物量、抗菌脂肽的產(chǎn)量和還原糖含量等相關(guān)指標(biāo),通過(guò)Origin軟件對(duì)數(shù)據(jù)的處理得到相應(yīng)的發(fā)酵參數(shù)和模型方程。得到最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h,最小生物量 Cx.0=9.56×106 cfu/g,最大生物量Cx.max=3.20×108 cfu/g,最大比生長(zhǎng)速率μm=0.16593 h-1,最小抗菌脂肽產(chǎn)量Cp

10、.0=0.61275 g/kg,最大抗菌脂肽產(chǎn)量Cp.max=10.42448 g/kg,最大比生長(zhǎng)速率πm=0.14697 h-1,,最初還原糖量 Cs.0=10.41958,b=0.46058。得到的3個(gè)動(dòng)力學(xué)方程皆有高度的擬合度,說(shuō)明通過(guò)它們得到參數(shù)具有可靠性,同時(shí)為工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論支持。
　　4.抗菌脂肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦促生長(zhǎng)及非特異性免疫指標(biāo)的影響
　　通過(guò)將抗菌脂肽分別按0mg/(kg·feed)(A0對(duì)

11、照組)、50mg/(kg·feed)(A1組)、100mg/(kg·feed)(A2組)、150mg/(kg·feed)(A3組)、200mg/(kg·feed)(A4組)的添加量添加到飼料中對(duì)對(duì)蝦進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌脂肽能顯著促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)和提高對(duì)蝦血清和肝胰腺中 POD、AKP、LZM、T-SOD和T-AOC活性,從而提高對(duì)蝦的非特異性免疫能力,最終提高了對(duì)蝦的抗病能力,最終確定抗菌脂肽的最佳工作濃度為100 mg/(k

12、g·feed)。
　　抗菌脂肽作為水產(chǎn)飼料添加劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用,為突破對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的病害防控等制約產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題,為促進(jìn)水產(chǎn)飼料抗病添加劑的更新?lián)Q代,實(shí)現(xiàn)對(duì)蝦養(yǎng)殖的綠色化,在源頭上保障對(duì)蝦產(chǎn)品的質(zhì)量安全。
　　5.NT-6抗菌脂肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖源頭弧菌數(shù)的影響
　　通過(guò)將抗菌脂肽分別按0mg/(kg·feed)(A0對(duì)照組)、50mg/(kg·feed)(A1組)、100mg/(kg·feed)(A2組)、20

13、0mg/(kg·feed)(A3組)添加到飼料中對(duì)對(duì)蝦進(jìn)行喂養(yǎng)試驗(yàn),在對(duì)蝦自然養(yǎng)殖環(huán)境和染菌后分別對(duì)水體和蝦體中弧菌數(shù)的檢測(cè)以及檢測(cè)對(duì)蝦在染菌后的存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在對(duì)蝦自然養(yǎng)殖環(huán)境中實(shí)驗(yàn)組水體和蝦體中的副溶、溶藻弧菌數(shù)均比對(duì)照組低且都低于對(duì)蝦致病的弧菌數(shù)閾值;在染溶藻弧菌后各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的水體和蝦體中的溶藻弧菌數(shù)均在弧菌致病數(shù)閾值之上,但各個(gè)劑量組中的弧菌數(shù)明顯低于對(duì)照組,說(shuō)明抗菌脂肽可以有效抑制水體、蝦體中的弧菌數(shù)。
　　芽孢