對(duì)蝦特定腐敗菌生物被膜的形成特性及抗菌脂肽的控制作用.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦營養(yǎng)豐富，一定條件下會(huì)促進(jìn)特定腐敗菌的生長繁殖，對(duì)蝦加工環(huán)境為腐敗菌形成生物被膜提供了極其有利的條件。凡納濱對(duì)蝦常見的特定腐敗菌又稱為特定腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSO）有金黃桿菌、假單胞菌、希瓦氏菌和摩根菌，它們易粘附在食品接觸面甚至在蝦殼表面形成生物被膜，不但會(huì)腐蝕設(shè)備、形成生物污垢、降低熱傳導(dǎo)效率，更重要的其能成為隱蔽的污染源，造成產(chǎn)品的持續(xù)或交叉污染，縮短貨架期，影響產(chǎn)品的安全性

2、。本研究的目的在于了解凡納濱對(duì)蝦常見4種特定腐敗菌形成生物被膜的能力，并從中篩選出成膜能力較強(qiáng)的一株腐敗菌為代表，研究其生物被膜的形成特性和納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌脂肽AMPNT-6對(duì)該菌產(chǎn)生物被膜的控制。研究結(jié)果分析如下：
　　以凡納濱對(duì)蝦四種特定腐敗菌金黃桿菌（Chryseobacterium）SL-4、假單胞菌（Pseudoalteromonas）SL-1、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）SL

3、-3、摩根菌（Morganella）SL-11為研究對(duì)象，采用試管結(jié)晶紫染色法，研究不同培養(yǎng)基、接觸面對(duì)腐敗菌生物被膜形成的影響，利用96微孔法研究不同菌株之間形成生物被膜的情況，通過普通光學(xué)顯微鏡觀察玻片上生物被膜的黏附情況，并用掃描電鏡觀察不同接觸面上腐敗菌生物被膜的結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明，在 LB、TSB、BHI培養(yǎng)基中，形成生物被膜OD600值最大的是假單胞菌，其余依次為金黃桿菌、希瓦氏菌、摩根菌；并且四種腐敗菌在LB培養(yǎng)基中形成生

4、物被膜的量均較多，其次是在BHI培養(yǎng)基中，在 TSB中形成生物被膜的能力相對(duì)最低；在聚乙烯塑料片上，生物被膜的形成能力強(qiáng)弱依次為假單胞菌、希瓦氏菌、金黃桿菌、摩根菌；在不銹鋼片上，生物被膜形成能力強(qiáng)弱依次是希瓦氏菌、假單胞菌、金黃桿菌、摩根菌。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)假單胞菌和希瓦氏菌在玻片上粘附面積較大，而且比較致密，金黃桿菌和摩根菌相對(duì)而言較為松散。同時(shí)在掃描電鏡下觀察到，在聚乙烯塑料片上，假單胞菌和希瓦氏菌形成致密的矩陣狀被膜組織，并有微孔

5、洞鑲嵌在被膜上；在不銹鋼片上，金黃桿菌也形成矩陣狀被膜組織，希瓦氏菌形成多層次的較為致密的網(wǎng)絡(luò)狀被膜結(jié)構(gòu)；其它腐敗菌均相互粘附且較為松散。多種腐敗菌共同培養(yǎng)形成生物被膜的能力較單一菌種的形成能力強(qiáng)的強(qiáng)，腐敗希瓦氏菌能促進(jìn)其它菌株的成膜能力。綜合評(píng)估，發(fā)現(xiàn)希瓦氏菌在LB培養(yǎng)基中于不銹鋼片上形成生物被膜的能力最強(qiáng)，確定希瓦氏菌為為下一步試驗(yàn)菌株。
　　采用改良的96微孔板法，通過改變環(huán)境因素，研究不同培養(yǎng)時(shí)間、菌體濃度和不同理化因子、

6、幾種脅迫條件對(duì)腐敗希瓦氏菌生物被膜形成能力的影響；并分別通過玻璃試管法研究不同基質(zhì)及其濃度對(duì)希瓦氏菌成膜能力的影響；利用掃描電鏡觀察以不銹鋼片為接觸面對(duì)希瓦氏菌生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，希瓦氏菌在 LB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)約24h形成成熟的生物被膜；在各實(shí)驗(yàn)條件下，分別以30℃培養(yǎng)，2％NaCl濃度，pH為中性或略偏堿性，起始菌濃度為106-107CFU/mL時(shí)形成生物被膜的量最大。希瓦氏菌在不銹鋼片上形成成熟的生物被膜需要60h，

7、掃描電鏡觀察其形態(tài)為立體網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，被膜上鑲嵌有微孔道，內(nèi)部呈有規(guī)律的褶皺結(jié)構(gòu)。基質(zhì)的濃度和種類也會(huì)影響希瓦氏菌生物被膜的形成，如質(zhì)量濃度在20%以內(nèi)，希瓦氏菌在LB、蝦汁液中形成生物被膜的能力無顯著差異，但濃度高于20%時(shí)，希瓦氏菌更容易在蝦汁液中形成生物被膜。而Ca2+和一定濃度的Mg2+會(huì)抑制腐敗希瓦氏菌生物被膜的形成；葡萄糖的添加量對(duì)生物被膜的形成沒有明顯的影響。幾種脅迫條件如抗菌劑（75%酒精、H2O2、84消毒液、乙酸）的存

8、在對(duì)希瓦氏菌的成膜能力無顯著影響，但0.3%的NaClO會(huì)促進(jìn)生物被膜的形成。
　　牛津杯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌脂肽AMPNT-6對(duì)腐敗希瓦氏菌有較好的抑菌活性，抑菌圈能到達(dá)（23.14±1.43）mm，MIC值為0.3125mg/mL。采用試管結(jié)晶紫染色法可以得知AMPNT-6對(duì)不銹鋼片、蝦殼上的生物被膜均有較好的控制作用，其中抗粘附效果較清除作用好，2MIC的AMPNT-6即可對(duì)將生物被膜控制在較低的水平。微孔試驗(yàn)

9、研究得出：2MIC的AMPNT-6作用3h即可很好的抑制生物被膜的形成，作用24h達(dá)到最佳的清除效果。
　　初始階段加入 AMPNT-6，其主要作用于菌體，達(dá)到抗粘附的效果；生物被膜成熟后加入 AMPNT-6，其主要對(duì)胞外多聚物發(fā)生作用，達(dá)到對(duì)生物被膜的清除效果。掃描電鏡圖顯示抗粘附的過程中，AMPNT-6可以使菌體破損及阻止細(xì)菌的粘附來抑制被膜的形成；清除的過程中，AMPNT-6會(huì)破壞生物被膜的組織結(jié)構(gòu)，使被膜發(fā)生脫落。3MIC