AAF1基因在白念珠菌生物被膜形成中的作用研究.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文AAFI基因在白念珠菌生物被膜形成中的作用研究CriticalRoleofAAFIgeneinCalbicansBiofilmFormationInVitroalldInVIVO內(nèi)科學(xué)(傳染病學(xué))胡輝張永信教授盧洪洲教授章強(qiáng)強(qiáng)主任技師蟲各師專姓導(dǎo)導(dǎo)師組成員:2009年4月復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要AAFI基因在白念珠菌生物被膜形成中的作用研究中文摘要目的:白念珠菌所致深部感染的發(fā)病率明顯增高，嚴(yán)重病例難以治療，死亡

2、率高，部分病例與白念珠菌在體內(nèi)易形成生物被膜有關(guān)。本研究主要對AAFI基因在形成生物被膜中的作用和可能機(jī)制進(jìn)行探討。方法:首先使用基因拼接的方法構(gòu)建質(zhì)粒pHs卜u3du3一HsZ和自主表達(dá)AAFI基因的質(zhì)粒pHsl一GAAU3一HsZ。以CAI4為參考菌株(AAFIAAFI)，采用“ura一blaster”技術(shù)，使用質(zhì)粒pHsl一u3du3一HsZ轉(zhuǎn)化結(jié)合5一氟乳清酸(5一FOA)壓力篩選，將AAFI基因從基因組完全剔除，然后再轉(zhuǎn)入自主

3、表達(dá)質(zhì)粒pHSI一GAAU3一HsZ，構(gòu)建自主表達(dá)菌株。通過表型鑒定和不同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，構(gòu)建出實(shí)驗(yàn)所需的重組菌株。使用體外形成生物被膜模型和動物模型，通過倒置顯微鏡和掃描電鏡比較AAFI基因缺失菌株、AAFI自主表達(dá)菌株和參考菌株在形成生物被膜時的形態(tài)學(xué)差異。最后使用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測AAFI基因缺失菌株和AAFI基因自主表達(dá)菌株兩者的HWPI基因和ALS3基因表達(dá)水平，并對差異進(jìn)行比較。結(jié)果:通過基因拼接成功構(gòu)建了

4、質(zhì)粒PHsl一u3du3一HsZ和pHsl一GAAU3一HsZ。成功地將AAFI基因從基因組剔除，構(gòu)建出菌株MZ一2(△aan△aafl)，構(gòu)建出自主表達(dá)AAFI基因的菌株M3(△aafl△aanpGAP一AAFI)，并通過免疫印跡鑒定。形態(tài)學(xué)觀察不同菌株體外形成的白念珠菌生物被膜發(fā)現(xiàn):菌株MZ一2(△aan△aan)僅呈稀疏粘附，而菌株M3(△aafl△aanpGAP一AAFI)和參考菌株CA14(AAFIAAFI)均能形成典型的生物