抗白念珠菌生物被膜中藥成分的篩選及機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌（Candida albicans）是人類最常見的條件致病真菌，可導(dǎo)致深部感染危及生命。白念珠菌易在各種生物材料表面形成生物被膜，其主要特點(diǎn)是對臨床常見抗真菌藥物高度耐藥，并導(dǎo)致反復(fù)感染。本課題的研究目的是篩選具有抗白念珠菌生物被膜作用的中藥成分并研究其作用機(jī)制。在體外對29種天然產(chǎn)物進(jìn)行抗白念珠菌生物被膜活性的檢測，發(fā)現(xiàn)漢防己甲素(Tetrandrine，TET)、紫檀芪(Pterostilbene，PTE)單用具有顯著的體外

2、抗白念珠菌生物被膜活性。XTT法考察生物被膜形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TET、PTE對白念珠菌生物被膜形成和成熟生物被膜均有較強(qiáng)的抑制作用，SMIC80值分別為64μg/ml、32μg/ml。激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)、掃描電鏡實(shí)驗(yàn)確證了TET、PTE的抗生物被膜活性:32μg/ml TET、16μg/ml PTE加入后破壞了生物被膜的三維空間結(jié)構(gòu)，菌絲的形成被抑制。生物被膜干重測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了TET、PTE能夠抑制生物被膜的形成:加入TET

3、、PTE后形成的生物被膜與對照組相比干重顯著降低，PTE的作用效果尤為明顯。為了探討TET、PTE抑制白念珠菌生物被膜的作用機(jī)制，我們考察了這兩種天然產(chǎn)物對黏附、生長和菌絲形成的影響。我們首先采用表面疏水性(CSH)實(shí)驗(yàn)考查了TET、PTE對白念珠菌黏附作用的影響，結(jié)果表明TET、PTE處理后生物被膜CSH值減小，隨著TET、PTE濃度的升高，CSH值逐漸降低，呈劑量依賴性，PTE效果強(qiáng)于TET。采用時間-生長曲線實(shí)驗(yàn)分析考察TET、P

4、TE對白念珠菌生長作用的影響，結(jié)果表明TET濃度低于64μg/ml、PTE濃度低于32μg/ml時對白念珠菌的生長沒有影響。在4種菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中考查TET、PTE對菌絲形成的影響，結(jié)果表明TET在Spider培養(yǎng)基中能夠顯著影響菌絲的形成，而較低濃度PTE在四種菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均可影響菌絲的形成，抑制菌絲作用強(qiáng)于TET。然后，采用cDNA芯片分析和real-time RT-PCR分析從分子水平上考察PTE處理白念珠菌生物被膜形成以及菌

5、絲形成相關(guān)基因表達(dá)譜的變化，分析結(jié)果顯示PTE處理后，與被膜或菌絲形成相關(guān)的重要基因表達(dá)下調(diào)，包括編碼RAS信號傳導(dǎo)通路的GTPase的基因RAS1以及編碼細(xì)胞延伸蛋白的基因ECE1。另外，PTE處理后還能引起麥角甾醇合成相關(guān)基因、糖酵解/糖異生相關(guān)基因表達(dá)水平顯著降低，熱激蛋白編碼基因表達(dá)上調(diào)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與PTE作用于Ras/cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接相關(guān)。對TET采用real-time RT-PCR分析，結(jié)果表明TET處理后，菌

6、絲特異性基因HWP1，ALS3，ECE1表達(dá)水平顯著降低，編碼GTP-ase的基因RAS1、腺苷酸環(huán)化酶基因CYR1、編碼轉(zhuǎn)錄因子Efg1p的基因EFG1表達(dá)水平顯著降低，這與TET抑制菌絲形成的作用直接相關(guān)。動物實(shí)驗(yàn)方面，由于TET和PTE能明顯抑制白念珠菌菌絲的形成，而菌絲形成是白念珠菌致病的關(guān)鍵因素，我們在秀麗隱桿線蟲感染模型上考察TET、PTE的體內(nèi)抗白念珠菌活性，結(jié)果表明TET具有體內(nèi)抗白念珠菌活性。由于PTE抗生物被膜的作用