干擾素對豬肝臟關(guān)鍵藥物代謝酶CYP3A29的表達調(diào)控研究.pdf

1、細胞色素P450酶(cytochromeP450，CYP450)是機體重要的藥物代謝酶，涉及內(nèi)源性和外源性物質(zhì)以及幾乎所有藥物和其衍生物的代謝。另一方面，內(nèi)源性、外源性化合物也能夠誘導(dǎo)或抑制CYP450的表達，而嚴重影響著藥物的代謝、療效和安全性。CYP3A29是豬體內(nèi)最重要最豐富的藥物代謝酶之一，是人重要藥物代謝酶CYP3A4的研究模型。干擾素(Interferon，IFN)作為新型生物藥物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床及獸醫(yī)臨床，使用過程中

2、通常需要與其它藥物聯(lián)合應(yīng)用，以達到更好的效果，但其對機體藥物代謝酶的表達調(diào)控機制尚不清楚，由此導(dǎo)致的藥物代謝酶的表達及活性的變化嚴重影響著對藥物的代謝、療效和安全性，經(jīng)常導(dǎo)致藥效降低、產(chǎn)生毒副反應(yīng)及藥物殘留，給臨床合理用藥帶來了很大困難，既造成了藥物的浪費，又嚴重影響人和動物的健康。因此研究干擾素對豬CYP3A29表達調(diào)控的影響及其機制的調(diào)節(jié)，既能指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥，又能為醫(yī)學(xué)臨床合理用藥提供理論依據(jù)。本研究從細胞水平及動物活體水平研究了

3、干擾素對CYP3A29表達的影響，并探討了其分子機制，取得的結(jié)果如下:
　　1.IFN-α與IFN-γ在細胞水平對CYP3A29表達的影響
　　分離制備豬肝原代細胞，MTT還原法分別檢測IFN-α與IFN-γ對豬肝細胞活性影響，證實IFN-α與IFN-γ對其無細胞毒性作用;分別用不同劑量IFN-α與IFN-γ在不同時間點處理豬原代肝細胞和傳代肝細胞HepLi，應(yīng)用實時熒光定量PCR和Westen-blot檢測肝細胞的CYP3

4、A29在mRNA水平和蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)CYP3A29表達，且具有一定的時間、劑量相關(guān)性。
　　2.IFN-α與IFN-γ在動物活體水平對CYP3A29表達及酶活性的影響
　　分別用IFN-α與IFN-γ肌肉注射30日齡仔豬，采用差速離法(Differentialcelltrifugationmethod)制備豬肝微粒體。應(yīng)用實時熒光定量PCR和Westen-blot測定CYP3A29m

5、RNA和蛋白質(zhì)水平變化，結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)CYP3A29表達，且與細胞水平相一致;以人CYP3A4的特異性底物硝苯地平作為探針，尼群地平作為內(nèi)標，用高效液相色譜法測定硝苯地平氧化代謝產(chǎn)物氧化型硝苯地平含量，分析CYP3A29酶活性變化，表明豬CYP3A29基因與人CYP3A4基因一致，具有硝苯地平氧化代謝活性，且IFN-α與IFN-γ能激活CYP3A29酶代謝活性。
　　3.IFN-α與IFN-γ對孕烷受體

6、PXR表達的影響
　　分別用不同劑量IFN-α與IFN-γ在不同時間點處理豬原代肝細胞和傳代肝細胞HepLi，應(yīng)用實時熒光定量PCR和Westen-blot檢測PXR在mRNA水平和蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果表明IFN-α與IFN-γ均能顯著上調(diào)PXR表達，且與CYP3A29的表達具有一致性;動物實驗樣品熒光定量PCR和Westen-blot檢測結(jié)果與細胞水平檢測結(jié)果相一致。
　　4.IFN-α與IFN-γ對CYP3A29表達調(diào)控機

7、制
　　分別構(gòu)建PXR真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-PXR及6個CYP3A29不同長度啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒;在MTT還原法檢測轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB對豬肝細胞無細胞毒性作用基礎(chǔ)上，通過轉(zhuǎn)錄抑制試驗確定肝臟藥物代謝酶CYP3A29的啟動子在IFN-α與IFN-γ調(diào)控中的作用，采用細胞轉(zhuǎn)染PXR真核表達質(zhì)粒和siPXR使核受體PXR超表達或者沉默，轉(zhuǎn)染不同長度的CYP3A29啟動子片段，探討IFN-α與IFN-γ上調(diào)CYP3A29表達的分

8、子機制。實驗結(jié)果表明:(1)IFN-α與IFN-γ通過激活CYP3A29啟動子上調(diào)CYP3A29的表達，IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29轉(zhuǎn)錄部位是位于轉(zhuǎn)錄起始上游-1473至-1021區(qū)域;(2)IFN-α與IFN-γ處理細胞后，PXRmRNA上調(diào)先于CYP3A29mRNA發(fā)生，推斷PXR作為轉(zhuǎn)錄因子參與激活CYP3A29表達;(3)PXR超表達試驗和RNA干擾試驗表明IFN-α與IFN-γ激活CYP3A29的表達與核受體PXR