豬TREM2基因的克隆表達(dá)及針對豬TREM2胞外區(qū)多克隆抗體的制備.pdf

1、髓系細(xì)胞觸發(fā)受體作為先天性免疫受體中的一類，在宿主先天性防御中起著相當(dāng)重要的作用，到目前為止，對豬髓系細(xì)胞觸發(fā)受體的研究還沒有報導(dǎo)，為了深入了解豬髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2的生物學(xué)功能，首先根據(jù)GenBank預(yù)測的豬TREM2（NM_001256777.1）的全基因序列，從豬肺泡巨噬細(xì)胞中提取的RNA為模板擴(kuò)增TREM2的全基因片段，通過測序驗證擴(kuò)增序列的正確性。選取豬TREM2胞外區(qū)基因片段（438bp）連接到原核表達(dá)載體pET-28a中，利

2、用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了高效表達(dá)于包涵體中的重組TREM2蛋白（約21kDa）。利用親和層析技術(shù)純化獲得TREM2重組蛋白，以純化的TREM2重組蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠免疫約100μg，制備多抗血清，通過Western-Blot證明該多抗血清可以識別豬源TREM2分子。本研究不僅為進(jìn)一步研究豬TREM2在病原微生物感染中的作用做好鋪墊，而且為揭示豬TREM2在豬呼吸性疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究分為三個部

3、分：
　　1.豬TREM2基因的克隆與生物信息學(xué)分析
　　隨著TREM2分子在炎癥反應(yīng)中的作用越來越備受關(guān)注，尤其現(xiàn)在豬呼吸道疾病引起的炎癥反應(yīng)在我國獸醫(yī)臨床中的比例越來越大，其傳播速度快，發(fā)病迅速，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大災(zāi)難。因此，研究豬TREM2分子在豬呼吸道炎癥反應(yīng)中的作用具有極大的前景。本研究根據(jù)GenBank預(yù)測的TREM2（NM_001256777.1）的全基因序列，利用primer5.0設(shè)計擴(kuò)增引物，然后提取豬肺泡巨

4、噬細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板擴(kuò)增TREM2全基因片段，通過測序驗證擴(kuò)增序列的正確性。與GenBank中的參考序列及其編碼的氨基酸進(jìn)行比對，同時將豬TREM2基因的序列分別于人和小鼠的TREM2序列進(jìn)行遺傳的差異性分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析其氨基酸的親水性、跨膜區(qū)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測，旨在闡明TREM2蛋白抗原表位的分子生物學(xué)特性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、研制多克隆抗體和建立新型檢測方法提供理論依據(jù)和實(shí)驗依據(jù)。
　　2.豬TREM

5、2胞外區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及純化
　　根據(jù)克隆到的豬TREM2分子及序列生物信息學(xué)分析結(jié)果，選取豬TERM2分子的胞外區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，設(shè)計原核載體表達(dá)引物，將豬TERM2分子的胞外區(qū)連接到表達(dá)載體pET-28a中。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，通過對誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況，利用His-Trap鎳離子螯合層析柱將重組蛋白進(jìn)行純化，通過SD

6、S-PAGE電泳檢測蛋白純化情況。結(jié)果顯示在0.4mmol/L濃度的IPTG中表達(dá)14h可以使蛋白得到大量表達(dá)，并且純化成功，為多克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　3.抗豬TREM2多克隆抗體的制備及應(yīng)用
　　將純化得到的重組蛋白與弗氏佐劑按1:1的比例混合乳化，免疫小鼠，免疫量約100μg/只，第四次免疫一周后采血，分離血清得到多克隆抗體。通過Western-Blot證明多克隆抗體的特異性，結(jié)果顯示免疫得到的多克隆抗體不但能