唾液酸黏附素胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的原核表達及其多克隆抗體制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的以妊娠母豬繁殖障礙及各年齡階段豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染病，在豬體內(nèi)主要感染豬肺泡巨噬細胞(Porcinealveolarmacrophages，PAM)。與PRRSV感染相關(guān)的受

2、體主要有唾液酸黏附素(Sialoadhesin，Sn)、CD163分子受體和硫酸乙酰肝素(Heparinsulphate，HS)。其中Sn受體可以黏附PRRSV并介導PRRSV的內(nèi)吞作用。本文通過原核表達Sn胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域重組蛋白及制備多克隆抗體，為研究結(jié)合PRRSV的Sn受體胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的功能作用打下堅實基礎(chǔ)。
　　 本試驗從健康豬肺收集PAM細胞，提取PAM細胞總RNA，分析Sn受體基因胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其胞外區(qū)共有15個結(jié)構(gòu)

3、域，將其分成8段，用RT-PCR方法擴增出8個結(jié)構(gòu)域的基因片段，大小分別為267bp、504bp、518bp、556bp、510bp、478bp、481bp、535bp，將這八個基因片段分別亞克隆到PUCM-T載體中，進行序列測定。利用DNAStar軟件分析了八個結(jié)構(gòu)域的拼接序列與Genbank上發(fā)表的Sn受體胞外區(qū)核苷酸序列的同源性，結(jié)果為99.2％～99.6％。
　　 根據(jù)唾液酸黏附素受體基因序列，設(shè)計了八對5’端帶有Eco

4、RI酶切位點，3’端帶有SalI酶切位點的特異表達引物。根據(jù)設(shè)計的引物擴增出八段基因，大小分別為267bp、504bp、518bp、556bp、510bp、478bp、481bp、535bp。將所擴增出的基因片段分別亞克隆到原核表達載體pET32a中，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒PET-Sn1，PET-Sn2，PET-Sn3，PET-Sn4，PET-dSn5，PET-Sn6，PET-Sn7，PET-Sn8。其中將PET-Sn1，PET-Sn2，P

5、ET-Sn3在IPTG的誘導下成功表達，獲得了分子量大小分別約為28KDa、42KDa、41KDa的重組蛋白rSn1、rSn2、rSn3、與預期的蛋白分子量相符；通過優(yōu)化表達條件，大量表達重組蛋白，用尿素法對表達的蛋白進行純化與復性。純化重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，目的蛋白的純度分別達到85％、85％、87％。用rSn1、rSn2、rSn3純化蛋白分別免疫小鼠，制備抗重組蛋白rSn1、rSn2、rSn3的多克隆抗體，經(jīng)間接ELI