谷子抗拿捕凈基因的克隆和轉(zhuǎn)基因玉米的研究以及玉米抗拿捕凈體細(xì)胞無性系突變體的篩選.pdf

1、拿捕凈(Sethoxydim)是80年代初篩選出的一種高活性的除草劑,它屬于環(huán)己烯酮類,這類除草劑作用的靶蛋白是乙酰輔酶A羧化酶(ACCase).環(huán)己烯酮類除草劑被專門用來防治禾本科雜草,對雙子葉作物高度安全,但不能用于禾本科作物.由于這些除草劑具有用量少、活性高、在土壤中易分解等優(yōu)點,近年來在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用.該研究從高抗拿捕凈的谷子品系和普通谷子中克隆出了ACCase基因,并對它們的序列進(jìn)行了比較,找出了拿捕凈作用的靶位點序列.

2、在此基礎(chǔ)上,將抗性谷子中克隆的ACCase基因轉(zhuǎn)入玉米自交系中,獲得抗拿捕凈的轉(zhuǎn)基因植株.同時采用組織培養(yǎng)的方法篩選玉米抗性突變體,獲得了有價值的抗性材料,并對其抗性機制進(jìn)行了探討.在體細(xì)胞無性系突變體的篩選方面,我們直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度梯度的拿捕凈,通過多輪篩選,最后存活的愈傷組織被認(rèn)為是抗性愈傷組織.對抗性愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo),最終分化成苗.該實驗共采用了兩個處理:處理一(采用0.5、1、2、5、10 μ M的拿捕凈濃度梯度)最終

3、獲得了31棵再生植株;處理二(采用5、10、20、50μ M的濃度梯度篩選)僅有綜31獲得了一個抗性愈傷組織,但無法分化成苗,該愈傷組織在200 μ M的拿捕凈濃度下依然能維持旺盛生長.克隆了這個抗性愈傷組織的質(zhì)體ACCase基因,序列比對發(fā)現(xiàn),它編碼的氨基酸并沒有發(fā)生改變.Southern blotting結(jié)果表明,它與對照的雜交信號并沒有明顯的變化,但雜交條帶的大小發(fā)生了變化.Northern blotting結(jié)果表明,雜交信號比對

4、照增加了2.5倍.根據(jù)禾本科作物質(zhì)體ACCase cDNA序列的保守性,直接采用RACE技術(shù)從高抗拿捕凈的谷子品系和野生型谷子中克隆出ACCase基因,采用生物信息學(xué)的方法證明所克隆的基因編碼質(zhì)體ACCase而非胞質(zhì)溶膠ACCase.將它們的氨基酸序列與其它物種的真核型ACCase相比較,發(fā)現(xiàn)抗拿捕凈谷子質(zhì)體ACCase氨基酸序列的1780處為異亮氨酸,而野生型谷子的為亮氨酸,從而驗證了質(zhì)體ACCase CT功能域的這個單一的氨基酸殘基

5、是拿捕凈作用的靶位點,它的突變造成了谷子對拿捕凈抗性的改變.Southern blotting結(jié)果表明,質(zhì)體ACCase基因在谷子中只有一個拷貝.將克隆的谷子抗拿捕凈質(zhì)體ACCase全長cDNA構(gòu)建到植物表達(dá)載體中.首先對植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行了改造,去除了篩選標(biāo)記基因,將35S啟動子換上了在禾本科植物細(xì)胞中高效表達(dá)的啟動子UBI,去除了GUS基因,最后將抗拿捕凈谷子質(zhì)體ACCase全長cDNA構(gòu)建到其上.采用根癌農(nóng)桿菌