谷子抗銹基因RLr1的AFLP標記和抗銹相關基因片段的克隆.pdf

1、谷子銹病是嚴重影響谷子產量的主要病害之一，當前培育和利用谷子抗銹品種仍然是控制其危害的一種經濟有效措施。尋找與抗銹基因緊密連鎖或連鎖的分子標記和克隆抗銹基因，對于抗谷子銹病基因的分離和利用具有重要意義。 本研究對高抗銹病親本十里香和高感病親本豫谷l號及其F1、F2代分離群體進行接種鑒定和AFLP標記。同時，根據(jù)已知植物抗銹基因并結合抗病基因保守結構域設計簡并引物，擴增谷子基因組中的抗銹基因同源序列，并利用Genomic Walking技

2、術進行擴增延伸。主要取得以下結果: 1.對高抗親本十里香、高感親本豫谷1號、親本雜交Fl代、Fl代自交F2代群體進行抗銹性接種鑒定，調查發(fā)病情況。結果發(fā)現(xiàn):十里香和Fl代全表現(xiàn)抗病，豫谷1 號表現(xiàn)感病，F(xiàn)2代表現(xiàn)明顯出現(xiàn)抗感分離?？垢蟹蛛x的統(tǒng)計分析結果顯示:F2代群體抗感分離比例符合3:l。因此說明，十里香的抗銹性受顯性單基因控制，該抗銹基因暫命名為RLrl。 2.采用限制性內切酶Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切谷子基因組

3、DNA銀染檢測的方法，對谷子F2代分離群體進行AFLP分析。隨機選擇102對AFLP引物組合對F2分離群體的抗銹基因池和感銹基因池進行分析，發(fā)現(xiàn)有33對引物組合能揭示兩親本間的多態(tài)性。 3.對篩選出的33對引物組合利用F2代單株進行重復驗證篩選，結果發(fā)現(xiàn):引物組合E-CTT/M-ACA和E-CTT/M-TAC能夠在親本和F2代分離群體間穩(wěn)定擴增出特異多態(tài)性條帶。引物組合E-CTT/M-ACA在母本豫谷1號和感銹植株中擴增出分子量

4、為180 bp的特異條帶(E1)，而父本和抗銹植株中沒有擴增出此條帶；引物組合E-CTT/M-TAC能夠在父本十里香和抗銹植株中擴增出分子量為256 bp的特異條帶(E2)，而母本和感銹植株中沒有擴增出此條帶。數(shù)據(jù)統(tǒng)計后經MapMaker 3.0軟件分析，結果分子標記E1與抗銹基因無連鎖；分子標記E2與抗銹病基因RLrl連鎖，遺傳距離是7.4 eM。將所得特異條帶回收、克隆和測序。通過網上同源性比對，E2與轉位蛋白亞基SecY有62％的

5、同源性。該蛋白調控分泌蛋白在細胞膜上的運輸。 4.根據(jù)已知抗銹基因結合抗病基因核苷酸結合位點(nucleotide binding site，NBS)、富含亮氨酸重復(Leucine-rich repeats LRR)保守結構域設計引物，以豫谷1號為對照從谷子cDNA中擴增出2個抗銹基因同源片段，分別為1 420bp和686bp。然后結合Genomic walking技術將2片段分別延長到3 120 bp和1 527 bp。2個