7，12-二甲基苯蒽（DMBA）體外誘導(dǎo)山羊乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)化.pdf

1、　　本試驗對山羊乳腺組織細胞的分離及原代培養(yǎng)方法進行了改進，并對乳腺上皮細胞的一些生長特性作了總結(jié)；在此基礎(chǔ)上，以7,12-二甲基苯蒽(DMBA)為致癌劑，佛波酯(TPA)為促癌劑，探索了乳腺上皮細胞體外兩步法轉(zhuǎn)化的過程，摸索了改良Feulgen染色的程序，為進一步利用ICM(顯微圖像分析儀)對轉(zhuǎn)化過程中核DNA含量的變化進行實時監(jiān)測奠定基礎(chǔ)，結(jié)果如下：1.用組織塊培養(yǎng)法和消化法均可獲得良好的山羊乳腺細胞原代培養(yǎng)物；培養(yǎng)的山羊乳腺成纖維

2、細胞比上皮細胞對胰蛋白酶更敏感，混合培養(yǎng)物用0.15﹪胰蛋白酶與0.02﹪EDTA消化液在37℃控時消化，先脫落下來的主要為成纖維細胞，經(jīng)過2～3代傳代篩選培養(yǎng)，即可得到純化的乳腺上皮細胞。2.用添加10﹪DMSO和10﹪胎牛血清的DMEM/F12為凍存液，按直徑不同將山羊乳腺組織塊分成3組：小于0.3mm，0.3～0.5mm和0.5～1.0mm，并適當延長體外平衡時間進行冷凍保存。結(jié)果表明：以直徑＜0.3mm，每管不超過6塊為佳，采用

3、室溫平衡6h后分兩次梯度添加DMSO至10﹪，于0℃平衡1h，-20℃平衡2h，直接投入到液氮中的凍存效果較好。3.用DMEM/F12體外培養(yǎng)山羊乳腺上皮細胞，傳至第9代時其生長仍正常。多數(shù)上皮細胞呈短梭形或多角形，呈蜂窩狀；部分細胞呈圓餅狀，體積較大。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對細胞上清液中的蛋白質(zhì)進行分離，其中有3個條帶與標準蛋白的3個條帶一致，表明山羊乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)條件下能表達山羊酪蛋白。4.以含5ug/mL、10ug

4、/mL、15ug/mLDMBA的完全培養(yǎng)液對組織塊和消化法得到的細胞分別進行36h，24h和12h處理后，施以25ng/mLTPA作用2周，結(jié)果顯示，15ug/mLDMBA作用12h組細胞基本死亡，5ug/mLDMBA36h組細胞轉(zhuǎn)化效果最佳；轉(zhuǎn)化細胞的初期形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為：細胞增大，扁平；隨后細胞核濃縮，細胞整體變?。唤又毎帕形蓙y，出現(xiàn)無規(guī)則生長；最后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化灶。5.應(yīng)用改良Feulgen染色法定量監(jiān)測轉(zhuǎn)化過程中細胞核DNA的變化，以