抗菌肽B在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞系中的高效表達(dá).pdf

1、本研究旨在通過基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體，使天蠶素CecropinB基因在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，建立抗菌肽防治哺乳動(dòng)物乳腺炎的轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)。另外本研究所構(gòu)建的真核表達(dá)載體含有報(bào)告基因EGFP的全部序列，其下游的調(diào)控序列兩端帶有限制性酶切位點(diǎn)，可為以后研究不同的真核基因調(diào)控序列提供方便可靠的模型。 本實(shí)驗(yàn)從免疫的家蠶蛹中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，獲得長為340bp的天蠶

2、素CecropinB的DNA片段，與預(yù)期的目的片段大小一致。將天蠶素CecropinB基因片段克隆劍pMD18-T載體上，經(jīng)雙酶切鑒定出的陽性克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GeneBank上的基因進(jìn)行同源性比較、分析，結(jié)果同源性為100％。將所得的pMD18-B質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切成粘性末端，回收后與同兩種酶雙切的pECFP-C1質(zhì)粒粘端進(jìn)行連接，篩選陽性重組子，依此方法構(gòu)建了真核表達(dá)載體pECFP-B。用膠原酶消化法對奶山羊乳腺上皮

3、細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)，并用免疫熒光染色法測定了乳腺上皮細(xì)胞中角蛋白18的表達(dá)，從而鑒定出分離培養(yǎng)的細(xì)胞為奶山羊乳腺上皮細(xì)胞。用陽離子脂質(zhì)體把載體pECFP-B轉(zhuǎn)入奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，所轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒中帶有EGFP報(bào)告基因，能夠表達(dá)熒光蛋白，在熒光倒置顯微鏡下可看到綠色的熒光。分別在mRNA水平上和蛋白活性水平上檢測抗菌肽CecropinB的表達(dá)情況，通過RT-PCR方法和抑菌圈活性檢測方法分別證明抗菌肽CecropinB可以在奶山羊乳腺上皮細(xì)

4、胞中進(jìn)行表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)初步建立了抗菌肽防治奶山羊乳腺炎的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，重組質(zhì)粒上還有Neor抗性基因，因此利用G418對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選，先用高濃度(800μg.mL-1)后用低濃度(200μg.mL-1)維持，一個(gè)月后，篩選出陽性細(xì)胞株，從而證明抗菌肽B能在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)還檢測了轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間抗菌肽的表達(dá)量，分別取了轉(zhuǎn)染后3d、7d、14d、21d和30d細(xì)胞破碎液用平板擴(kuò)散法檢測生物活性，以未轉(zhuǎn)染的同時(shí)期