亞硒酸鈉對延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞過氧化氫所致氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：本實驗以延邊奶山羊的乳腺上皮細(xì)胞作為實驗材料，確定最合適體外培養(yǎng)延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的最佳條件，并探究延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞在受到外源過氧化氫給予的氧化應(yīng)激刺激后，加入一定量的亞硒酸鈉以發(fā)揮其對乳腺上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并確定亞硒酸鈉對乳腺上皮細(xì)胞的最佳保護(hù)濃度。
　　方法：（1）分別用組織塊培養(yǎng)法和Ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化法兩種方法建立延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行純化，隨后對純化后的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的骨架蛋

2、白—角蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測；（2）用體外培養(yǎng)的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞傳代后進(jìn)行實驗。過氧化氫用DMEM/F12培養(yǎng)基分別稀釋為5、50、100、200、500μM，以DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對照組。過氧化氫處理4 h后，用MTT法觀察過氧化氫對乳腺上皮細(xì)胞活力的影響，用Hoechst33342/PI熒光染色法觀察過氧化氫損傷對乳腺上皮細(xì)胞的凋亡情況，DCFH-DA檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量；（3）將延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞分為3組：正常

3、組（對照組1），過氧化氫損傷組（對照組2），亞硒酸鈉保護(hù)組。MTT方法檢測細(xì)胞活力，Hoechst33342/PI雙染、Giemsa染色法檢測細(xì)胞凋亡情況，DHE染色法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。
　　結(jié)果：（1）使用組織塊培養(yǎng)法5~8天后，才開始出現(xiàn)少量乳腺上皮細(xì)胞，呈多角形和卵圓形。而采用Ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶消化法消化收集細(xì)胞時，經(jīng)3h后，消化所得到的細(xì)胞則大多為乳腺上皮細(xì)胞。利用免疫熒光染色法，結(jié)果顯示，純化后分離培養(yǎng)的乳腺上皮

4、細(xì)胞角蛋白呈陽性表達(dá)，證明其具有腺泡上皮的特性；（2）MTT活性檢測結(jié)果表明，各處理組的細(xì)胞存活率與未處理組存在顯著差異（P＜0.05）。5、50、100μΜH2O2作用4 h后，細(xì)胞存活率分別為：91.21％、77.50%、54.48%，而200、500μΜH2O2作用4 h后細(xì)胞存活率僅為35.53%、27.79%，乳腺上皮細(xì)胞死亡過多。Hoechst33342/PI染色結(jié)果表明，H2O2通過誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞的凋亡及壞死來降低細(xì)胞的

5、存活率。利用熒光探針DCFH-DA分析DGMECs活性氧水平，結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，會明顯增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平；（3）較對照組2比，濃度為0.25、0.5、1.0μg/mL的亞硒酸鈉保護(hù)組的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞活力上升，細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，ROS含量減少。其中以0.5μg/mL亞硒酸鈉處理組效果最顯著。說明0.5μg/mL的亞硒酸鈉可以減少過氧化氫所致的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的氧化損傷，提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞內(nèi)RO

6、S含量。
　　結(jié)論：（1）使用I型膠原酶及透明質(zhì)酸酶結(jié)合的消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，得到的上皮型細(xì)胞純度相對較高，成纖維細(xì)胞混雜相對較少。經(jīng)過2~3代純化，即可得到純化后的延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞；（2）用角蛋白單克隆抗體對體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，結(jié)果呈陽性，證明了其腺泡上皮的特性；（3）H2O2的加入導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡甚至壞死，且細(xì)胞內(nèi)ROS含量上升。說明H2O2可以模擬體內(nèi)環(huán)境，作為乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的誘

7、導(dǎo)物質(zhì)；（4）100μmol/L H2O2作用于細(xì)胞4h，導(dǎo)致細(xì)胞50%左右死亡，壞死比例小，ROS含量也相對較少，在此濃度下，細(xì)胞還具有恢復(fù)其功能的可能性。故選擇100μmol/L H2O2作用于延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞處理4 h，以建立氧化損傷模型。（5）0.5μg/mL SS能夠提高DGMECs抵制氧化應(yīng)激的能力，從而減少細(xì)胞的氧化損傷程度，提高其細(xì)胞活力；（6）通過Hoechst33342/PI及Giemsa染色結(jié)果知，SS的加入