乳清蛋白酶解物對過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷的保護作用.pdf

1、天然抗氧化肽因其天然性與安全性而在抗氧化領(lǐng)域備受矚目，因此開發(fā)及應(yīng)用蛋白源抗氧化肽具有十分廣闊的前景。乳清蛋白作為優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，已被眾多研究者關(guān)注，并從中開發(fā)出生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白中可提取出具有抗氧化活性的生物肽，然而至今為止多數(shù)研究主要還是集中于乳清蛋白酶解工藝的優(yōu)化和初步純化過程。本研究旨在揭示乳源性抗氧化肽對氧化損傷的體內(nèi)細胞的生物學(xué)效應(yīng)，完善抗氧化肽的應(yīng)激作用機制，引導(dǎo)抗氧化肽的應(yīng)用方向，同時也對功能性物質(zhì)的作用機制

2、研究提供方法學(xué)借鑒，具有理論指導(dǎo)意義和拓展性科學(xué)意義。
　　 首先通過雙酶（胃蛋白酶-胰蛋白酶）水解乳清蛋白，得到粗酶制備物后經(jīng)DA201-C型號大孔吸附樹脂吸附洗脫，脫去大量的鹽，產(chǎn)物（WPHs）的相對分子量主要分布在369～1980 Da，1000 Da以下片段的峰面積占總面積的61.51％；對WPHs的氨基酸組成分析顯示W(wǎng)PHs富含必需氨基酸（43.72％）和疏水性氨基酸（40.75％）；另外，WPHs具有良好的體外抗氧化

3、活性，清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基的IC50分別為10.56 mg/mL、5.76 mg/mL，濃度為10 mg/mL時還原能力 A700nm為0.577。PC12細胞接種至培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，經(jīng)不同濃度WPHs預(yù)孵2 h后，WPHs與100 μmol/L H2O2 共同處理24 h。細胞存活率（MTT法）結(jié)果顯示100～400 μg/mL濃度的WPHs可使H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細胞存活率提高20％～30％；WPHs對細胞本身

4、具有促進生長的作用，濃度100～400 μg/mL WPHs單獨作用24 h，促生長效果顯著，提高PC12細胞存活率1％～19％；100～200 μg/mL WPHs對過氧化氫損傷PC12細胞的形態(tài)有改善作用，能明顯減少皺縮及懸浮細胞數(shù)目。論文研究了WPHs抑制過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷的機理。采用酶試劑盒檢測細胞內(nèi)抗氧化酶系的活性，發(fā)現(xiàn)WPHs對PC12細胞總抗氧化能力及抗氧化酶系統(tǒng)有提高效果；細胞凋亡的檢測使用核染色法，結(jié)果顯示100～2

5、00 μg/mL WPHs可抑制H2O2 誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡，分別使細胞凋亡率下降8.3％～19％；應(yīng)用流式細胞術(shù)研究細胞內(nèi)Ca2+濃度情況及線粒體跨膜電位，發(fā)現(xiàn)200 μg/mL WPHs能夠穩(wěn)定胞內(nèi)Ca2+的濃度，并阻止細胞線粒體膜電位發(fā)生變化；用Caspase-3酶活試劑盒檢測PC12細胞Caspase-3酶的活性，發(fā)現(xiàn)WPHs可以降低過氧化氫誘導(dǎo)引起的Caspase-3酶活性的提高程度；與凋亡蛋白表達水平的檢測采用Weste