6-姜酚對(duì)過(guò)氧化氫致HUVEC損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 6-姜酚通過(guò)自噬對(duì)過(guò)氧化氫致HUVEC凋亡的保護(hù)作用
　　目的:動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展是一種多因素參與的復(fù)雜病理生理學(xué)過(guò)程。凋亡是誘發(fā)心血管細(xì)胞損傷的重要原因之一，多種可以引起動(dòng)脈粥樣硬化的致病因素均可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。在近期的研究中，關(guān)于自噬與凋亡在心臟疾病中的相互關(guān)系，以及自噬所起的調(diào)節(jié)作用受到很大關(guān)注。自噬在心血管功能及形態(tài)的維持中起著非常重要的作用，研究自噬在血

2、管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用，可以為動(dòng)脈粥樣硬化治療提供新思路。很多植物化學(xué)物可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，6-姜酚作為一種植物化學(xué)物具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，但具體的機(jī)制尚不完全清楚，本研究著重探討自噬是否在6-姜酚抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為研究對(duì)象，應(yīng)用不同濃度的6-姜酚(10-40μM)預(yù)處理24小時(shí)后，再與H2

3、O2(800μM)共同作用1小時(shí)。用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測(cè)不同劑量的6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC存活率的變化，同時(shí)應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin)預(yù)處理，檢測(cè)6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC存活率的變化;用Hoechst33342熒光染色和annexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;用熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)Cy

4、to-ID(R) Green染色的自噬體的變化;用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ，自噬相關(guān)蛋白Bcl-2、Beclin-1、mTOR、p-mTOR表達(dá)量的變化;用激光共聚焦顯微鏡觀察HUVEC溶酶體穩(wěn)定性的變化;用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)(ROS)的含量變化，還原性谷胱甘肽(GSH)水平的改變，線粒體膜電位的變化，同時(shí)應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理，檢測(cè)6-姜酚和

5、H2O2作用后，HUVEC內(nèi)ROS和GSH水平的變化。
　　結(jié)果:(1)凋亡的結(jié)果:H2O2(800μM)作用1小時(shí)后，應(yīng)用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下可見(jiàn)胞核濃染，濃縮或碎裂的凋亡細(xì)胞。用6-姜酚(10-40μM)預(yù)處理后，鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯下降，熒光分布區(qū)域減少，呈明顯的量效關(guān)系;annexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC凋亡的結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，H2O2處理組凋亡細(xì)胞明顯的增多(P＜0

6、.01)，經(jīng)6-姜酚保護(hù)后，各劑量組的細(xì)胞凋亡的數(shù)目明顯減少，并呈明確的量效關(guān)系(P＜0.01)。(2)自噬的結(jié)果:經(jīng)過(guò)Cyto-ID(R)Green染色后，熒光顯微鏡觀察對(duì)照組和H2O2處理組綠色點(diǎn)狀熒光較少，而6-姜酚保護(hù)組中，自噬體所發(fā)出明亮綠色熒光物質(zhì)逐漸增多;Western blot結(jié)果顯示自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)隨6-姜酚濃度增加而增加，呈明顯的量效關(guān)系(P＜0.01);(3)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果:Western bl

7、ot結(jié)果顯示對(duì)照組與H2O2處理組未見(jiàn)到明顯的Bcl-2，Beclin-1，及p-mTOR蛋白的表達(dá)。而6-姜酚保護(hù)組中，隨6-姜酚濃度增加，Bcl-2,Beclin-1蛋白的表達(dá)量逐漸增加，而p-mTOR蛋白表達(dá)逐漸減少(P＜0.01)。(4)氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果:熒光分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示H2O2處理組中ROS水平顯著上升，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，而6-姜酚保護(hù)組巾，隨6-姜酚濃度增加，ROS水平顯著降低(P＜0.05

8、或P＜0.01);H2O2處理組中GSH水平顯著下降(P＜0.01)，而6-姜酚保護(hù)組中，隨6-姜酚濃度增加，GSH水平顯著提高（P＜0.05或P＜0.01）。應(yīng)用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后，ROS水平顯著升高，GSH水平顯著降低，與未加3-MA組比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);加入雷帕霉素(100nmol/L)預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著降低，GSH水平顯著升高，與未加雷帕霉素組比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、(P＜0.05或P＜0.01)。(5)溶酶體線粒體結(jié)果:熒光分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示H2O2處理后，線粒體膜電位水平顯著下降(P＜0.01)，用6-姜酚預(yù)處理后，可升高HUVEC線粒體的膜電位水平(P＜0.05或P＜0.01);激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，H2O2處理組，AO熒光強(qiáng)度較弱(P＜0.01)，提示細(xì)胞溶酶體穩(wěn)定性降低，而對(duì)照組和6-姜酚預(yù)處理組，AO熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，提示6-姜酚可以提高細(xì)胞溶酶體的穩(wěn)定性(P＜0.05或P＜0.01

10、)。
　　結(jié)論:1、H2O2(800μM)作用于HUVEC1小時(shí)后可引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，6-姜酚(10-40μM)預(yù)處理24小時(shí)后可抑制凋亡的發(fā)生。2、6-姜酚作用于HUVEC可引起細(xì)胞自噬的發(fā)生。3、自噬相關(guān)蛋白Bcl-2，Beclm-1蛋白表達(dá)增加，p-mTOR蛋白表達(dá)減少，提示自噬的發(fā)生可能與mTOR信號(hào)通路和Beclin1復(fù)合物有關(guān)。4、氧化應(yīng)激的結(jié)果顯示，H2O2處理后，ROS水平升高，GSH水平下降，6-姜酚預(yù)處理后可降

11、低ROS水平，升高GSH水平，推測(cè)自噬有潛在的抗氧化應(yīng)激的作用。5、6-姜酚作用后可使HUVEC溶酶體穩(wěn)定性增加，線粒體的膜電位水平升高，從而抑制凋亡的發(fā)生。
　　第二部分 6-姜酚對(duì)過(guò)氧化氫致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷的保護(hù)作用
　　目的:冠心病的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是心血管疾病發(fā)生的始動(dòng)因素。大量實(shí)驗(yàn)證明血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA損傷與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，活性氧是導(dǎo)致DNA損傷的直接原因之一，當(dāng)活性氧的產(chǎn)

12、生與細(xì)胞抗氧化能力失衡時(shí)就會(huì)造成氧化應(yīng)激(oxidative stress)，引起活性氧增加，通過(guò)復(fù)雜機(jī)制導(dǎo)致DNA損傷。本研究的目的是檢測(cè)6-姜酚作為一種抗氧化劑，能否保護(hù)過(guò)氧化氫致HUVEC的DNA損傷，并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為研究對(duì)象，用H2O2作為誘導(dǎo)劑，建立DNA損傷模型。應(yīng)用不同濃度的6-姜酚(10-40μM)預(yù)處理24小時(shí)后，再與H2O2(50μM)共同作用1小時(shí)。用單細(xì)胞凝膠電

13、泳（彗星實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷情況;用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化，GSH水平的改變，線粒體膜電位的變化，溶酶體膜穩(wěn)定性的改變;用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)量的變化。所用試驗(yàn)應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸(NAC，10 mM)作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　結(jié)果:(1) DNA損傷結(jié)果:H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時(shí)后，引起DNA鏈斷裂，細(xì)胞形成彗星樣拖尾現(xiàn)象，尾長(zhǎng)、尾部DNA/頭部DNA(％)及尾矩

14、明顯大于對(duì)照組(P＜0.01)。用6-姜酚(10，20，40μM)處理HUVEC24小時(shí)，然后與H2O2組溫育1小時(shí)，SCGE試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)明顯減輕(P＜0.05或P＜0.01)。(2)氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果:用2'，7'-二氫二氯熒光素(DCFH)和苯二醛(OPT)分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS以及GSH水平，結(jié)果顯示，H2O2作用于HUVEC1小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升，GSH水平顯著下降，用6-姜酚預(yù)處理后，可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，顯著升

15、高GSH水平。與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并呈明顯的量效關(guān)系(P＜0.05或P＜0.01)。(3)溶酶體線粒體結(jié)果:H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定性顯著降低(P＜0.01）。HUVEC經(jīng)6-姜酚預(yù)處理24小時(shí)后，再與H2O2溫育1小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜的穩(wěn)定性顯著高于H2O2組(P＜0.05或P＜0.01)。將H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位顯著降低(P＜0.01)。經(jīng)10μM

16、-40μM濃度的6-姜酚處理24小時(shí)后，再與H2O2作用1小時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增高，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位升高，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系(P＜0.05或P＜0.01)。(4) p53蛋白表達(dá)的結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示H2O2(50μM)組p53蛋白表達(dá)明顯，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。6-姜酚(40μM)預(yù)處理24小時(shí)后，再與H2O2共同作用1小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)水平明顯下降，與單獨(dú)H2O2組相比有顯著性差

17、異（P＜0.01）。NAC陽(yáng)性對(duì)照組，p53蛋白表達(dá)水平較低，與單獨(dú)H2O2組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:1、H2O2(50μM)作用于HUVEC1小時(shí)后可引起細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，6-姜酚(10-40μM)預(yù)處理24小時(shí)后可抑制DNA損傷的發(fā)生。2、H2O2(50μM)可引起HUVEC內(nèi)ROS生成增加，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH耗竭，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，6-姜酚可減少H2O2引起HUVEC內(nèi)ROS水平的升高，并使