黃芩莖葉總黃酮對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 本研究采用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cells，HUVEC)損傷，建立HUVEC氧化損傷模型，觀察黃芩莖葉總黃酮(SSTF)對(duì)氧化損傷HUVEC的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.HUVEC氧化損傷模型的建立;
　　 體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用H2O2誘導(dǎo)HUVEC損傷。

2、實(shí)驗(yàn)分：正常對(duì)照組(normal control)，H2O2損傷1-9組(濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、4、5、8、10mmol/L)，損傷時(shí)間定為4小時(shí)、8小時(shí)，采用倒置顯微鏡觀察不同濃度H2O2對(duì)HUVEC形態(tài)學(xué)變化的影響。測(cè)定損傷時(shí)間為4小時(shí)正常對(duì)照組、H2O2損傷組(H2O2濃度分別為0.5、1、2、4mmol/L)各組細(xì)胞活力(MTT法)，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性。
　　 2.SSTF對(duì)H

3、UVEC氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究;
　　 實(shí)驗(yàn)分①正常對(duì)照組；②H2O2損傷組(H2O2濃度為2mmol/L)；③-⑤依次為SSTF低、SSTF中、SSTF高濃度組：在培養(yǎng)液中先加入終濃度為100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的SSTF孵育24小時(shí)，再加入2mmol/L的H2O2誘導(dǎo)損傷：⑥陽性對(duì)照VC組：在培養(yǎng)液中先加入終濃度為20 mg/LVC孵育24小時(shí)，再加入2mmol/L的H2O2誘導(dǎo)損傷。4小

4、時(shí)后終止培養(yǎng)，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力(OD值)，測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)的含量、超氧化物岐化酶(SOD)活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常對(duì)照組、H2O2損傷組、SSTF高濃度組、VC組細(xì)胞的凋亡率；以及采用western-blot法測(cè)定各組細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.HUVEC氧化損傷模型的建立;
　　 1.1、倒置顯微鏡觀察不同濃度H2O2對(duì)H

5、UVEC形態(tài)學(xué)的影響;
　　 損傷時(shí)間達(dá)到8小時(shí)，H2O2低濃度組細(xì)胞損傷很明顯，濃度稍高時(shí)，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，細(xì)胞變圓、腫脹，細(xì)胞膜邊緣模糊不清，較多細(xì)胞脫落死亡。因而我們最終選擇了損傷時(shí)間為4小時(shí)。此條件下，0.1mmol/L和0.2mmol/L H2O2損傷組與正常組相比，細(xì)胞形態(tài)并無明顯區(qū)別，0.5mmol/L和lmmol/L H2O2損傷組與正常組相比，細(xì)胞形態(tài)稍有區(qū)別，但是細(xì)胞損傷尚不明顯。2mmol/L H2O2損傷組

6、，與正常組比較，細(xì)胞形態(tài)有明顯變化，細(xì)胞有些變形，但細(xì)胞邊界尚清楚。4mmol/L H2O2損傷組細(xì)胞變形明顯，胞膜邊緣不清晰，有較多細(xì)胞脫落。
　　 1.2、不同濃度H2O2對(duì)HUVEC氧化損傷的影響;
　　 ①各濃度H2O2損傷組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞活力(OD值)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；②0.5mmol/L、lmmol/L H2O2損傷組與正常組比較，LDH活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，2mmol/L

7、、4mmol/L H2O2損傷組和正常組相比，LDH活性差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著(P＜0.01)。
　　 2.SSTF對(duì)HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究
　　 2.1、保護(hù)作用
　　 ①除SSTF低濃度組與H2O2損傷組比較，細(xì)胞活力(OD)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05)，其它兩組藥物組與H2O2損傷組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；②SSTF各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性均明顯低

8、于H2O2損傷組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.2、保護(hù)機(jī)制;
　　 ①SSTF各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量明顯低于H2O2損傷組(P＜0.05或P＜0.01)；②SSTF各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性均明顯高于H2O2損傷組(P＜0.05或P＜0.01)；③SSTF組細(xì)胞凋亡率明顯低于H2O2損傷組(P＜0.01)；④H2O2損傷組Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組(P＜0.01)，SSTF各濃度組Bc

9、l-2蛋白表達(dá)水平明顯高于H2O2損傷組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.H2O2體外誘導(dǎo)HUVEC氧化損傷模型的建立：2mmol/LH2O2作用4小時(shí)，為適合本實(shí)驗(yàn)研究的最佳條件。
　　 2.SSTF可對(duì)抗H2O2，提高細(xì)胞活力，降低LDH的活性，從而對(duì)氧化損傷的HUVEC起到保護(hù)作用。
　　 3.SSTF對(duì)氧化損傷HUVEC的保護(hù)機(jī)制可能與對(duì)抗自由基，降低脂質(zhì)過氧化物MDA的含量、增加SOD