黃芩莖葉總黃酮對ox-LDL致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷，建立氧化損傷模型，觀察黃芩莖葉總黃酮(SSTF)對氧化損傷HUVEC的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集人新鮮血清，采用肝素沉淀法提取LDL，通過CuSO4氧化法制備成ox-LDL，硫代巴比妥酸(TBA)檢測ox-LDL的氧化修飾程度，并以考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白濃度。
　　2.體外培養(yǎng)HUVEC，給予

2、不同濃度的ox-LDL，通過觀察細(xì)胞形態(tài)改變，MTT法測定各組細(xì)胞活力(OD值)，TBA法測定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，誘導(dǎo)建立氧化損傷模型。
　　3.采用半定量RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測不同ox-LDL損傷濃度下NADPH氧化酶4(NOX4)mRNA和蛋白表達(dá)變化，了解其在ox-LDL致HUVEC氧

3、化損傷機(jī)制中的作用。
　　4.通過MTT法檢測各濃度組SSTF(25，50，100，200，400 mg/L)作用24、48、72h對HUVEC活性的影響。給予不同濃度SSTF(低、中、高)干預(yù)處理氧化損傷的模型，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，檢測MDA、SOD、ROS指標(biāo)變化以及NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)變化。觀察SSTF對ox-LDL致HUVEC氧化損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.提取分離

4、的LDL，經(jīng)0.45％瓊脂糖凝膠電泳證實為單一條帶。TBA測定結(jié)果提示提取的LDL被成功氧化成ox-LDL。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白濃度為480μg/mL。
　　2.不同濃度的ox-LDL(12.5、25、50、100、200mg/L)作用于HUVEC后，細(xì)胞活性(OD值)與對照組相比顯著下降，MDA含量升高，SOD活性下降，ROS水平呈濃度依賴性升高，尤以100、200mg/L的ox-LDL作用最為明顯。
　　3.

5、顯微鏡下觀察ox-LDL損傷濃度為100mg/L組細(xì)胞變形，但輪廓清楚。200mg/L組細(xì)胞出現(xiàn)破裂，邊界不清，細(xì)胞有脫落現(xiàn)象。
　　4.50、100、200mg/L濃度組的ox-LDL氧化損傷細(xì)胞后，細(xì)胞的NOX4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.SSTF各濃度組(25、50、100、200、400 mg/L)分別直接作用于正常HUVEC24、48、72h，MTT結(jié)果顯示，OD值顯著

6、增加，可見SSTF在上述劑量范圍時對HUVEC無毒副作用，且具有明顯的促增殖作用。
　　6.SSTF低、中、高濃度組干預(yù)處理損傷組細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著提高。另外，經(jīng)過SSTF作用后檢測的細(xì)胞上清中MDA含量顯著降低，SOD活性提高，ROS的生成明顯減少。 SSTF濃度組能顯著地降低ox-LDL氧化損傷的HUVEC NOX4 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.氧化低密度脂蛋白可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，其損傷