左卡尼汀對(duì)過(guò)氧化氫損傷人HL7702肝細(xì)胞的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：左卡尼?。↙-carnitine，LC）又稱左旋肉堿，是人體必需的一種類維生素營(yíng)養(yǎng)素，在動(dòng)物性食品中含量豐富。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肝病病人體內(nèi)LC缺乏，外源性補(bǔ)充LC對(duì)多種肝病具有輔助治療作用。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，LC對(duì)多種因素誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。目前，LC保肝作用分子機(jī)制尚未闡明，本課題將建立過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的人HL7702肝細(xì)胞損傷模型，從抗氧化、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（Nrf2、MAPK、P

2、I3K/Akt、PPAR-α、AMPK、GSK-3β）的角度探究LC保護(hù)肝細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。
　　方法：⑴LC對(duì)H2O2損傷HL7702肝細(xì)胞活性及抗氧化能力的影響：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為：正常對(duì)照組、H2O2損傷組、LC組（0.1、0.5、1.0 mmol/L）。分別以MTT、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）法檢測(cè)細(xì)胞活性；酶化學(xué)法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧

3、化氫酶（catalase，CAT）活性及丙二醛（MDA）含量；以2,7-二氯氫化熒光素二酯（DCFH-DA）為熒光探針，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。⑵LC對(duì)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase，HO-1）通路的調(diào)控：Western blot技術(shù)檢測(cè)Nr

4、f2、HO-1蛋白的經(jīng)時(shí)表達(dá)；免疫熒光染色法確定Nrf2的核轉(zhuǎn)位；凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）評(píng)價(jià)Nrf2-DNA結(jié)合活性；Nrf2 siRNA技術(shù)分析Nrf2與HO-1的級(jí)聯(lián)關(guān)系及Nrf2在LC保護(hù)肝細(xì)胞損傷中的作用。⑶LC對(duì)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosph

5、atidylinositol3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路的調(diào)控：Western blot測(cè)定H2O2損傷HL7702細(xì)胞MAPK、PI3K/Akt通路的變化及LC的影響；應(yīng)用相應(yīng)抑制劑，分析 JNK、ERK、p38MAPK在 H2O2損傷 HL7702細(xì)胞中的作用；采用 Akt抑制劑 IV評(píng)價(jià) Akt是否參與了LC的保護(hù)作用以及LC對(duì)Nrf2/HO-1通路的激活作用。⑷LC對(duì)H2O2損傷HL

6、7702細(xì)胞脂肪酸代謝、能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響：Western blot技術(shù)檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptors-α，PPAR-α）的經(jīng)時(shí)表達(dá)，并從 mRNA和蛋白水平測(cè)定 LC對(duì) PPAR-α及其下游基因肉毒堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶1（CPT1）、脂肪?；o酶A氧化酶（ACOX）的影響；分析PPAR-α在LC保護(hù)細(xì)胞損傷中的作用及與SOD、CAT的相關(guān)性；測(cè)

7、定H2O2損傷HL7702細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK)、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的經(jīng)時(shí)變化特點(diǎn)及 LC的調(diào)節(jié)作用；應(yīng)用相應(yīng)抑制劑分析 AMPK在 LC保護(hù)細(xì)胞損傷中的作用以及PI3K/Akt、AMPK與GSK-3β的級(jí)聯(lián)關(guān)系。
　　結(jié)果：①以0.3mmol/LH2O2損傷HL7702細(xì)胞12 h為病理

8、模型。0.1?1.0 mmol/L LC劑量依賴性抑制了 H2O2引起的細(xì)胞活性降低及 LDH釋放（P<0.05，P<0.01）。與正常對(duì)照組相比，H2O2損傷組細(xì)胞SOD和CAT蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.01），SOD和CAT活性分別下降了30.07％和38.26％，ROS及MDA水平顯著增加，分別為對(duì)照組的3.8倍和1.7倍；LC能夠抑制H2O2引起的SOD、CAT蛋白表達(dá)及活性的降低，以及ROS、MDA水平的增加（P<0.05

9、，P<0.01）。②經(jīng)時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，H2O2損傷1 h細(xì)胞核Nrf2表達(dá)迅速升高，隨后逐漸降低，HO-1表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)；LC預(yù)孵育對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Nrf2核轉(zhuǎn)位、Nrf2-DNA結(jié)合活性升高及HO-1蛋白表達(dá)增加均有明顯促進(jìn)作用（P<0.05）；Nrf2 siRNA技術(shù)將細(xì)胞Nrf2沉默后，抑制了LC的保護(hù)作用及增強(qiáng)HO-1表達(dá)的作用。③H2O2損傷后p-JNK、p-ERK、p-p38MAPK表達(dá)均迅速升高，p-Akt表達(dá)呈先升高

10、后降低的雙相改變；LC能有效抑制H2O2引起的p-JNK、p-p38MAPK表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01），但對(duì)p-ERK表達(dá)無(wú)明顯影響；LC既能增強(qiáng)損傷1 h時(shí)p-Akt的升高（P<0.01），又能抑制損傷12 h時(shí)p-Akt的降低（P<0.01）。除ERK抑制劑外，JNK、p38MAPK、Akt抑制劑均能有效抑制H2O2引起細(xì)胞活性降低（P<0.05），且Akt抑制劑也抑制了LC對(duì)Nrf2/HO-1通路的激活作用。④H2O2

11、損傷肝細(xì)胞時(shí)PPAR-α蛋白表達(dá)逐漸降低；LC預(yù)孵育能增強(qiáng)PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX的表達(dá)（P<0.05，P<0.01）；PPAR-α激動(dòng)劑能有效抑制H2O2引起的SOD、CAT活性及細(xì)胞活性的降低；PPAR-α抑制劑阻斷了LC增強(qiáng)SOD、CAT表達(dá)及細(xì)胞活性的作用。p-AMPK、p-GSK-3β表達(dá)在H2O2損傷后逐漸降低，LC對(duì)其均有明顯抑制作用（P<0.01），且能抑制AMPK上游激酶肝激酶B1（Liver kin

12、ase B1，LKB1）及下游底物乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）的活性降低（P<0.05，P<0.01）。AMPK抑制劑阻斷了LC增強(qiáng)細(xì)胞活性及p-GSK-3β表達(dá)的作用，Akt抑制劑對(duì)LC增強(qiáng)p-GSK-3β表達(dá)的作用無(wú)影響。
　　結(jié)論：⑴LC保護(hù)H2O2損傷HL7702細(xì)胞的作用與升高SOD、CAT活性，降低ROS及MDA水平有關(guān)。⑵LC通過(guò)激活A(yù)kt/Nrf2/HO-1通路保護(hù)H2O

13、2誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞損傷。⑶JNK、p38MAPK的激活參與H2O2損傷HL7702細(xì)胞，LC的保護(hù)作用與抑制JNK、p38MAPK的激活有關(guān)；ERK未參與H2O2的損傷作用，且與LC的保護(hù)作用無(wú)關(guān)。⑷PPAR-α參與了H2O2誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞損傷。LC通過(guò)增加PPAR-α及其下游基因CPT1、ACOX表達(dá)，激活LKB1/AMPK/ACC通路，抑制GSK-3β活性而保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞損傷，且PPAR-α表達(dá)增加