PPARγ保護原代皮層神經元過氧化氫損傷的研究.pdf

1、目的：
　　觀察過氧化氫（H2O2）誘導的體外原代培養(yǎng)皮層神經元損傷中，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR?）的表達及活性改變，以及PPAR激活或抑制對神經元過氧化氫損傷產生的影響，探討PPAR對神經元氧化應激損傷的保護作用。
　　實驗方法：
　　1、原代培養(yǎng)皮層神經元：取出生24h之內Sprague-Dawley新生鼠皮層神經元細胞進行體外原代培養(yǎng)，培養(yǎng)7天（d7）進行純度鑒定，并用于各種處理和檢測。
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2、、神經元過氧化氫損傷模型：以不同濃度的過氧化氫作用于d7神經元，于不同作用時間后進行評價，選取合適濃度及作用時間應用于后續(xù)實驗。
　　3、細胞形態(tài)學觀察：包括光鏡下觀察，即將不同組別細胞置于將倒置相差顯微鏡下，觀察其形態(tài)變化，并采集圖像；神經元MAP2免疫熒光染色，即用MAP2抗體標記神經元，熒光顯微鏡下觀察不同組別細胞形態(tài)完整性的改變，并采集圖像。
　　4、MTT比色法檢測細胞相對存活率，即檢測不同組別神經元經處理后細胞活

3、性的改變。
　　5、分別提取總蛋白和核蛋白，Western blotting法檢測不同組別細胞內PPARγ、p-PPARγ（磷酸化 PPARγ）、p-ERK1/2（磷酸化 ERK1/2，即 ERK1/2的活性形式）、Bcl-2、活化的Caspase-3、Nrf2的表達水平。
　　6、qRT-PCR法觀察 PPARγ靶基因：提取不同組別神經元 RNA，qRT-PCR技術對PPARγ靶基因表達水平進行檢測。
　　7、ELI

4、SA法檢測PPARγ-DNA結合活性：應用PPARγ轉錄因子分析試劑盒檢測不同組別神經元 PPARγ與過氧化物酶體增殖物反應元件（PPRE）的結合活性。
　　8、反義寡核苷酸法降低神經元PPARγ：用PPARγ反義寡核苷酸處理原代培養(yǎng)d7神經元細胞，抑制PPARγ表達。
　　實驗結果：
　　1、體外培養(yǎng)正常皮層神經元2d后，大多細胞呈圓形或橢圓形，可見較細小的細胞突起，至第7天時神經元胞體立體感強，形態(tài)飽滿，突起變長且

5、增粗，并相互交織成網。用神經元特異性抗體微管相關蛋白2（MAP2）對進行免疫熒光染色，鑒定神經元陽性率達95％以上，是相對純的神經元培養(yǎng)，可用于后續(xù)實驗。
　　2、將過氧化氫作用于神經元，可造成神經元損傷，輕者細胞腫脹變圓，細胞突起斷裂或消失；重者細胞發(fā)生崩解，可見較多細胞碎片，并呈現劑量-時程依賴效應。選取濃度為500?M、作用6~24小時進行后續(xù)實驗。
　　3、過氧化氫抑制神經元PPAR?蛋白表達，同時增加PPAR?滅活

6、；抑制ERK1/2激活可以拮抗過氧化氫對PPAR?的滅活作用。
　　4、外源性給予PPAR?激動劑羅格列酮減輕神經元過氧化氫損傷、增加Bcl-2及Nrf2表達，同時抑制活化的Caspase-3表達；而PPAR?抑制劑GW9662可以拮抗羅格列酮的保護作用、降低Bcl-2及Nrf2表達、增加活化的Caspase-3表達。
　　5、降低PPAR?表達，對正?；A狀態(tài)下的神經元形態(tài)和存活率無明顯影響，但使神經元對過氧化氫損傷更敏感

7、，增加過氧化氫誘導的Bcl-2、Nrf2、活化的Caspase-3表達的改變，同時可以降低外源性給予PPAR?激動劑羅格列酮所產生的保護作用。
　　實驗結論：
　　1、在體外原代培養(yǎng)皮層神經元中，過氧化氫可能通過負性調節(jié)PPAR?（即表達下調和活性降低）引起神經元損傷。
　　2、在體外原代培養(yǎng)皮層神經元中，外源性激活PPARγ可以保護神經元過氧化氫損傷，而神經元自身PPARγ的表達可能是神經元自我保護機制之一。