山羊乳腺分泌上皮細胞單克隆培養(yǎng)及miR-200c對ACACA基因靶向調(diào)控研究.pdf

1、乳腺分泌上皮細胞是乳腺中唯一能夠合成、分泌乳汁的細胞，體外培養(yǎng)的具有分泌功能的乳腺分泌上皮細胞是研究乳腺泌乳功能的重要工具。本研究通過活體采集嶗山奶山羊乳腺組織，利用組織塊貼壁法獲得原代乳腺上皮細胞，純化后通過顯微操作法對乳腺上皮細胞進行單克隆培養(yǎng)，并通過形態(tài)觀察、生長曲線繪制、廣譜角蛋白和波形蛋白免疫熒光染色、相關(guān)基因的RT-PCR等方法對單克隆細胞系進行鑒定，以獲得徹底純化的奶山羊乳腺分泌上皮細胞系。以嶗山奶山羊不同泌乳時期乳腺組織

2、miRNA高通量測序數(shù)據(jù)為基礎，分析miR-200c與ACACA基因的靶向關(guān)系。以嶗山奶山羊單克隆乳腺分泌上皮細胞為試驗材料，通過載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染，利用qRT-PCR、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)及Western-blot等方法驗證miR-200c與ACACA基因的靶向關(guān)系。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)采用組織塊培養(yǎng)法分離得到了嶗山奶山羊原代乳腺上皮細胞，初步純化后，利用顯微操作法，獲得并擴繁了乳腺分泌上皮細胞的單克隆培

3、養(yǎng)體系;
　　(2)單細胞克隆培養(yǎng)獲得的奶山羊乳腺分泌上皮細胞，形態(tài)整齊、生長旺盛，具有典型的上皮細胞形態(tài)特征和‘S’型細胞生長曲線，廣譜角蛋白和波形蛋白表達均呈陽性，并且能夠表達ACACA基因和β-酪蛋白基因;
　　(3)不同泌乳時期乳腺組織miRNA高通量測序數(shù)據(jù)顯示，miR-200c在不同泌乳時期表達量差異顯著，靶基因預測結(jié)果顯示miR-200c與ACACA基因3'UTR存在一個互補結(jié)合位點;
　　(4) qRT

4、-PCR結(jié)果顯示，miR-200c成功轉(zhuǎn)染細胞并過表達;轉(zhuǎn)染miR-200c mimic的細胞中，ACACA基因的表達量低于對照組，而miR-200c inhibitor轉(zhuǎn)染組的ACACA基因表達量高于miR-200c mimic組;結(jié)果表明miR-200c的表達量與ACACA基因的表達量呈負相關(guān);
　　(5)雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-200c mimic和ACACA-3'UTR野生型熒光素酶報告基因載體，

5、其熒光素酶活性極顯著低于miR-200cmimic和ACACA-3'UTR突變型載體的共轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)，同時顯著低于miR-200cinhibitor和ACACA-3'UTR野生型熒光素酶報告基因載體的共轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)。結(jié)果表明miR-200c mimic可與預測到的ACACA-3'UTR作用位點結(jié)合，并抑制熒光素酶的表達;
　　(6) Western-blot結(jié)果顯示，miR-200c mimic轉(zhuǎn)染組中ACAC