一、肝癌細胞來源的邊群細胞的分化及抗凋亡能力的研究;二、人類Bcrp基因的克隆和Tg737基因在邊群細胞中缺失突變情況的檢測.pdf

1、腫瘤的形成過程目前尚未在學術界獲得統(tǒng)一的認識。以往的隨機理論認為基因的變異以一種完全隨機的方式在細胞內(nèi)積累，并且細胞隨機的發(fā)生了惡性的轉變。該理論在試圖揭示臨床種種現(xiàn)象時遇到了困難，比如獲得性耐藥等。近年來腫瘤干細胞理論得到了越來越多的實驗支持。研究發(fā)現(xiàn)急性髓細胞樣白血病細胞中能分離出與骨髓造血干細胞具有相同干細胞表面標志的癌細胞，這些細胞能在免疫缺陷小鼠中誘導急性髓細胞樣白血病的發(fā)生；這表明腫瘤組織中可能存在既具有干細胞特征，又具有腫

2、瘤特征的腫瘤干細胞。目前，有文獻報道，在多種實體瘤中發(fā)現(xiàn)有腫瘤干細胞的存在，例如乳腺癌、腦腫瘤等。原發(fā)性肝細胞肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，由于預后差，死亡率較高。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，肝癌組織內(nèi)的細胞在耐藥性上存在差異，這種異質性的表現(xiàn)間接暗示了腫瘤干細胞的存在。對這群細胞的分離和鑒定對闡明肝癌發(fā)病機理、揭示肝癌復發(fā)和轉移的機制具有重要的意義。 邊群細胞是最近干細胞研究領域最熱門的一個研究方向。由于該類細胞表面表達人類乳癌耐藥蛋白（BC

3、RP），且該膜蛋白能夠排出Hoechst33342，從而使用流式細胞儀能夠對其進行分選。該方法首先在分離骨髓造血干細胞上獲得了成功，隨后的研究表明，利用該方法可以從多種組織中高效、快速地分離得到成體干細胞。 目的： 利用Hoechst33342染色、流式細胞儀分離技術分離人類肝癌細胞系來源的邊群細胞。在體外培養(yǎng)的情況下，對邊群細胞的分化能力和抗凋亡能力進行檢測。對人類乳癌耐藥蛋白進行克隆，對人類Tg737基因在邊群細胞中

4、的缺失突變情況進行檢測。 方法： 1. 對人類肝癌細胞系MHCC97、hHCC、Bel-7402中的邊群細胞進行分析，對MHCC97中的邊群細胞進行分選； 1) 細胞常規(guī)培養(yǎng)； 2) 0.25％胰酶溫和消化細胞，常規(guī)離心并以HBSS液洗滌細胞； 3) 細胞懸液分為兩組，一組單純用Hoechst33342進行染色，另一組同時加入鈣通道拮抗劑和相同濃度的Hoechst染料，兩組細胞均染色90分鐘

5、，然后以流式細胞儀檢測肝癌細胞中的Hoechst熒光，通過使用雙色性反射濾鏡和不同的組合濾片將每個肝癌細胞中熒光信號分為兩個部分—Hoechst藍光部分和Hoechst紅光部分，采集這些光信號，并利用流式細胞軟件形成二維散點圖，分析兩組肝癌細胞在二維散點圖上的形態(tài)，通過設定“門”找出肝癌細胞中的邊群細胞，并邊群細胞進行分析和分選。 2. 邊群細胞的分化能力的檢測 1）根據(jù)Genebank中提供的甲胎蛋白（AFP）和細

6、胞角蛋白19（CK19）的基因序列，使用Primer5引物設計軟件分別對兩條基因進行半定量引物的設計，并送公司合成。分別以邊群細胞和非邊群細胞兩種細胞群的cDNA為模板，行半定量檢測。提取兩群細胞的總蛋白，對AFP和CK19行蛋白定量檢測； 2）將兩群細胞接種蓋玻片，分別行AFP和CK19雙色免疫熒光檢測，以及Bcrp的免疫熒光檢測； 3）將兩群細胞分別接種裸鼠，待成瘤后對瘤體冰凍切片，對片子行AFP和CK19的雙色免疫

7、熒光檢測。 3. 邊群細胞的抗凋亡能力的檢測 1）分選后的兩群細胞進行常規(guī)培養(yǎng)12小時，待細胞全部貼壁后，以PBS緩沖液替換完全培養(yǎng)基，按培養(yǎng)3、6、9個小時分別分組； 2）根據(jù)Genebank中提供的p53、Bcl-2和Bax的基因序列，使用Primer5引物設計軟件分別對三條基因進行半定量引物的設計，并送公司合成。分別以經(jīng)上述處理并分組的細胞的cDNA為模板，行半定量檢測。提取細胞的總蛋白行蛋白定量檢測；

8、 3) 分選后的細胞接種96孔板，常規(guī)培養(yǎng)貼壁后，以PBS緩沖液替換完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3、6、9個小時，使用MTT法檢測細胞在營養(yǎng)缺乏的情況下的增殖能力； 4）分選后的細胞分別接種蓋玻片，常規(guī)培養(yǎng)并按上述方法處理，并對細胞行Bcl-2和Bax的雙色免疫熒光檢測。 4. 人類乳癌耐藥蛋白（Bcrp）的克隆根據(jù)Genebank中提供的Bcrp的基因序列，使用Primer5引物設計軟件設計Bcrp的巢式引物，以邊群細胞的

9、cDNA為模板行聚合酶鏈反應，將反應產(chǎn)物進行電泳，并回收電泳中的目的條帶，克隆入pMD18T載體，送生物公司測序。 5. 人類Tg737基因在邊群細胞中的缺失情況的檢測根據(jù)Genebank中提供的Tg737的基因序列，使用Primer5引物設計軟件設計Tg737的引物，以邊群細胞的cDNA為模板行聚合酶鏈反應，將反應產(chǎn)物進行電泳，并回收電泳中目的條帶，克隆入pMD18T載體，送生物公司測序。 結果： 1. 流

10、式細胞儀的雙波長熒光分析結果顯示在二維散點圖上有邊群細胞存在。其中，MHCC97細胞系中邊群細胞的比例接近0.25％，hHCC細胞系中比例接近0.5％，Bel-7402細胞系中比例接近0.45％。加入鈣通道拮抗劑后該群細胞明顯減少，因為低熒光的特征消失而進入到了非邊群細胞群中，這表明三種肝癌細胞的邊群細胞的表型均與Bcrp載體的主動外泵作用有關； 2. 通過半定量檢測、蛋白定量以及免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)MHCC97來源的邊群細胞中

11、AFP和CK19均有表達，而AFP表達水平明顯較非邊群細胞中為高。通過體外成瘤實驗，發(fā)現(xiàn)瘤體中僅有部分細胞同時表達AFP和CK19。而對體外培養(yǎng)的邊群及非邊群細胞行Bcrp的檢測，發(fā)現(xiàn)高度表達Bcrp的細胞位于邊群細胞形成的克隆的中心周圍，呈環(huán)形排列，而非邊群細胞形成的克隆中也有表達Bcrp的細胞存在； 3. 通過MTT法，發(fā)現(xiàn)在營養(yǎng)缺乏情況下，邊群細胞較非邊群細胞的生長增殖能力為強。通過半定量分析和蛋白定量分析，發(fā)現(xiàn)在邊群細

12、胞中，Bcl-2的表達水平上調(diào)，Bax的水平出現(xiàn)下調(diào)，而非邊群細胞中剛好相反。免疫熒光的分析結果同上。 4. 將測序結果與Genebank中人類乳癌耐藥蛋白的序列進行比對，結果顯示，pMD18T載體中所含有的基因片斷與人類乳癌耐藥蛋白的基因序列同源性達到99％。 5. 將測序結果與Genebank中人類Tg737基因的序列進行比對，結果顯示，pMD18T載體中所含有的基因片斷與人類Tg737的基因序列相比，出現(xiàn)大片斷

13、的缺失和點突變。缺失部分位于第345個至第401個堿基，第1048個至第1148個堿基，第1650個堿基至第1741個堿基以及第2436個堿基至第2546個堿基之間，共缺失359個堿基。點突變位于第793個堿基，由C突變?yōu)門，蛋白產(chǎn)物由絲氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?結論： 1. 利用Hoechst33342染料通過流式細胞儀技術確認人類肝癌細胞系MHCC97、hHCC和Bel-7402中存在邊群細胞。 2. MHC

14、C97來源的邊群細胞共同表達AFP和CK19，這提示了邊群細胞確實具有一定的雙向分化能力。這說明邊群細胞具有一定的原始特征。 3. 邊群細胞體外培養(yǎng)形成的克隆中，Bcrp強陽性的細胞呈環(huán)形圍繞克隆中心分布，提示了邊群細胞在分裂增殖的過程中，以環(huán)形向外生長，外圍和中心的細胞都是由邊群細胞分裂而來的非邊群細胞，分裂后仍保持邊群細胞特征的細胞都處于中心和外圍細胞之間。非邊群細胞體外培養(yǎng)形成的克隆中，也有Bcrp強陽性的細胞存在，但是

15、，這些細胞數(shù)量較少，且在克隆中散在分布。這個發(fā)現(xiàn)，與臨床上腫瘤中心常為壞死組織的現(xiàn)象一致，也提供了先化療后手術的實驗基礎。非邊群細胞形成的克隆中有邊群細胞的存在，說明流式細胞儀分選過程可能不夠完善，有少數(shù)邊群細胞漏網(wǎng)，或者可能是有比邊群細胞更原始的細胞存在，而這些細胞的特征尚不為人所知。 4. 在營養(yǎng)缺乏的條件下，相比較非邊群細胞，邊群細胞具有更加明顯的抗凋亡能力。并且，與非邊群細胞相反，邊群細胞中的Bcl-2表達上調(diào)，而Ba

16、x表達下調(diào)，促進了邊群細胞的存活。這可能是邊群細胞較非邊群細胞具有明顯的抗凋亡能力的機制所在。 5. 人類乳癌耐藥蛋白Bcrp被成功克隆入pMD18T載體，測序同源性99％，可以用于后續(xù)的實驗。 6. 人類Tg737基因在邊群細胞內(nèi)出現(xiàn)大片斷的缺失和點突變。由于該基因位于13號染色體的著絲粒附近，乙肝病毒x蛋白或其它機制對該區(qū)具有破壞作用，可導致該區(qū)多種基因缺失變異。因此，該基因缺失的一種可能原因是病毒感染或其它機制