抑癌基因Tg737在肝癌發(fā)病機(jī)制中作用的初步研究.pdf

1、肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，其死亡率在惡性腫瘤中僅次于胃、食道而居第三位。在我國每年約有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。研究表明原發(fā)性肝癌的預(yù)后比較差的主要原因是缺乏特異的早期診斷指標(biāo)和治療手段，而研究肝癌的發(fā)病機(jī)理有助于提高肝癌的早期診斷率，指導(dǎo)肝癌的正確治療。
　　Tg737基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種肝癌抑癌基因，最初進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因與遺傳性多囊腎病（autosomal recessive polycystic

2、kidney disease,ARPKD）orpk鼠突變模型研究中的目的基因相同。但到目前為止，對于Tg737基因在肝癌發(fā)病過程中的如何發(fā)揮作用并不十分清楚。因此，進(jìn)一步揭示Tg737基因的生物學(xué)功能，豐富和發(fā)展肝癌發(fā)生發(fā)展理論，為肝癌早期診斷及治療提供依據(jù)有著十分重要的意義。
　　本研究共分三個(gè)部分：
　　第一部分：Tg737基因在肝癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究
　　目的：觀察Tg737基因在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并分析

3、其與肝癌的相關(guān)性。
　　方法：采用RT-PCR和Western blot方法檢測人肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中Tg737mRNA和蛋白的表達(dá)，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對表達(dá)情況與肝癌的相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：人正常肝細(xì)胞系HL-7702中Tg737的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平均高于肝癌細(xì)胞HepG2和MHCC97。65例肝癌組織標(biāo)本中有30例Tg737mRNA表達(dá)呈陽性，且表達(dá)水平較相應(yīng)癌旁組織低；34例檢測出Tg737蛋白的陽性表達(dá)

4、。而65例癌旁組織中有61例檢測出Tg737mRNA的陽性表達(dá)；59例Tg737蛋白表達(dá)呈陽性。18例早期（Ⅰ-Ⅱ）肝癌組織中15例Tg737蛋白表達(dá)呈陽性，47例中晚期（Ⅲ-Ⅳ）肝癌中19例呈陽性，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：Tg737基因作為肝癌的抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要因素，檢測Tg737基因的表達(dá)可能作為判斷肝癌分期的參考指標(biāo)。
　　第二部分：Tg737基因?qū)Ω伟┘?xì)胞活性的影響

5、>　　目的：構(gòu)建Tg737基因的真核表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中，觀察該基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞增殖活性的影響。
　　方法：以臨床獲取的人正常肝組織的mRNA為模板，通過RT-PCR方法獲得Tg737基因全長序列，將其克隆至pEGFP-C1載體，進(jìn)行序列、酶切鑒定。將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為三組：HepG2-Tg737組（pEGFP-Tg737轉(zhuǎn)染組）、HepG2-vect組（空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組）和HepG2組（空白對照組），利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將

6、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG2中；通過Real-time PCR及Western blot方法明確轉(zhuǎn)染48h后，各組細(xì)胞中Tg737的表達(dá)情況，并通過流式細(xì)胞儀和MTT比色法觀察其對細(xì)胞周期和活性的影響。
　　結(jié)果：我們成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-Tg737，將其轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG248h后，HepG2-Tg737組細(xì)胞中Tg737mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯高于HepG2-vect組和HepG2組。與其它兩組相

7、比，HepG2-Tg737組細(xì)胞生長明顯受到抑制，G1期細(xì)胞比例高于HepG2-vect組和HepG2組，S期細(xì)胞比例明顯較低。
　　結(jié)論：Tg737基因能夠過表達(dá)于肝癌細(xì)胞HepG2中，并可抑制該細(xì)胞的增殖能力。
　　第三部分肝癌中Tg737基因雜合性缺失的研究
　　目的：檢測肝癌中Tg737基因的雜合性缺失情況，并分析微衛(wèi)星位點(diǎn)雜合性缺失與臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（

8、PCR-SSCP）檢測Tg737基因的五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(RH65721、RH118612、SHGC-57879、STS-U20362和G64212)雜合性缺失情況，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對缺失情況與肝癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：Tg737基因的五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)RH65721、RH118612、SHGC-57879、STS-U20362和G64212的LOH發(fā)生頻率分別為61.54％(32/65)、52.31％(34/65)、

9、65.45％(36/65)、58.33％(28/65)、74.47％(35/65)；五個(gè)位點(diǎn)之間的LOH發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。微衛(wèi)星位點(diǎn)SHGC-57879和G64212的LOH發(fā)生率與肝癌的轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論：Tg737基因在肝癌中存在較大比例的雜合性缺失，其微衛(wèi)星位點(diǎn)表現(xiàn)出較高的不穩(wěn)定性，影響基因的表達(dá)。
　　通過以上的研究，初步證實(shí)了Tg737基因在肝癌發(fā)生的過程中發(fā)揮著