塞來昔布聯(lián)合HMME-PDT對腫瘤細胞的殺傷作用及機制的研究.pdf

1、隨著醫(yī)學的深入研究和經(jīng)驗的積累，在癌癥的治療方面，盡管外科手術(shù)，放療，化療等傳統(tǒng)的治療方式取得了長足的進步，然而治療效果仍不盡人意。近十年來腫瘤學的生物靶向治療蓬勃發(fā)展，但由于癌癥發(fā)生過程的復雜性，單獨治療模式往往效果不好，以分子機制為基礎(chǔ)的聯(lián)合作用有望取得更好的療效。 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種誘生性酶，受到各種細胞因子、生長因子及腫瘤活化因子等刺激后表達水平迅速升高，其主要功能是把花生

2、四烯酸轉(zhuǎn)變成前列腺素。COX-2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，涉及細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及細胞免疫機制等方面。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤包括肝癌、鼻咽癌、肺癌、大腸癌、前列腺癌及乳腺癌等都存在COX-2的高表達。因此COX-2可能成為惡性腫瘤治療的新靶點。 體外研究證實COX-2特異性抑制劑能促進腫瘤細胞的凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)在體條件下COX-2特異性抑制劑能抑制多種腫瘤的形成和／或轉(zhuǎn)移。但COX-2抑制劑

3、單獨作用對腫瘤的抑制效應有限，用量過大增加其副作用，與其他療法聯(lián)合應用有可能提高其抗腫瘤效應。 光動力學療法(photodynamic therapy,PDT)是一種新型的腫瘤治療方法。它利用光敏劑分子接受特定波長的光能后通過光化學反應和能量傳遞過程將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能，在有氧條件下，產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，包括單線態(tài)氧(1O2)、氧自由基、羥自由基等，從而破壞蛋白質(zhì)、核酸和

4、脂類等生物大分子，導致細胞凋亡或壞死。PDT獨特的優(yōu)勢是毒副作用非常小，能治療多種腫瘤且不易產(chǎn)牛耐藥性。研究顯示PDT治療腫瘤的過程中誘導了COX-2的表達，故給予COX-2抑制劑有可能提高PDT的治療效果。因此COX-2抑制劑聯(lián)合PDT成為目前研究的熱點。以往體內(nèi)外研究已經(jīng)部分證實COX-2特異性抑制劑可以顯著提高PDT的治療效果，這些研究所用到的光敏劑為Photofrin、5-ALA或Hypericin；所用到的光源為熒光燈、染料激

5、光器或鹵素燈。而以血卟啉單甲醚(HMME)為光敏劑，發(fā)光二極管(LED)為光源的PDT聯(lián)合塞來昔布對CNE-2和HepG2細胞的研究還未見報道。 本課題擬采用CNE-2和HepG2細胞研究塞來昔布(celecoxib)聯(lián)合血卟啉單甲醚(HMME)介導的PDT對腫瘤細胞增殖的影響，MTT法取得塞來昔布的劑量、光敏劑的濃度及激光能量密度實驗參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果，同時通過Annexin V／PI雙染法定量檢測凋亡率，流式技術(shù)觀察線粒體膜電位

6、的變化，Caspase-3試劑盒測定藥物作用前后caspase-3活性的變化，并采用免疫組化法檢測藥物處理后COX-2的表達變化情況，初步探討可能的作用機制。 方法： 實驗分為空白對照組、單獨塞來昔布組(CNE-2：64～125μ M；HepG2：40.96～80μM)、單獨PDI、組(2.5 μg／ml HMME，0～0.5J／cm。)及塞來昔布聯(lián)合PDT組。將CNE-2和HepG2細胞分別分組處理后，MTT法檢測各組

7、作用24h后的抑制率。采用金氏公式評估聯(lián)合作用對腫瘤細胞的殺傷足否具有協(xié)同效應，每種細胞各選出一組具有協(xié)同效應的聯(lián)合模式用于以下試驗的研究。 經(jīng)MTT法選出CNE-2細胞的聯(lián)合模式為：control、CX(80 μ M)、PDT(2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2)及CX+PDT；HepG2細胞的聯(lián)合模式為：control、CX(64μM)、PDT(2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2)及CX+PDT。

8、CNE-2和HepG2細胞經(jīng)以上聯(lián)合模式處理后觀察以下指標：HE染色光鏡觀察、Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察各組處理24h后細胞及細胞核的形態(tài)學變化；Annexin V／PI雙染流式細胞儀檢測各組處理24h后的細胞凋亡率；Rhodamine 123染色流式細胞儀檢測各組處理6h后線粒體膜電位的變化情況；Caspase-3活性檢測試劑盒檢測各組處理16h后caspase-3酶活性的變化，并采用Bradford蛋白濃度測定試劑

9、盒測定蛋白濃度，caspase-3酶活性的結(jié)果用蛋白濃度標準化；免疫細胞化學法檢測各組處理24h后COX-2的表達情況。應用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.塞來昔布對CNE-2、HepG2細胞的抑制率呈劑量依賴性。64 μ M和80 μ M的塞來昔布對CNE-2細胞的抑制率分別是4.84％和13.23％，這兩個濃度的塞來昔布對HepG2細胞的

10、抑制率分別是17.17％和34.48％?？梢奌epG2細胞對塞來昔布更敏感。 光敏劑濃度為2.5μg/ml、光照射劑量分別為O．125 J／cm2、0.25 J／cm2和0.5J／cm2時，CNE-2和HepG2細胞的抑制率分別為13.76％、28.34％、39.5％和15.57％、25.14％、39.72％，說明HMME-PDT對兩種細胞的殺傷作用呈劑量依賴性，由數(shù)據(jù)可看出PDT對兩種細胞的增殖影響差別不大。 塞來昔布

11、和PDT聯(lián)合處理兩種腫瘤細胞，金氏公式分析聯(lián)合效應的結(jié)果顯示：(1)對于CNE-2細胞，64 μ M和80μ M的塞來昔布與光敏劑濃度為2.5μg/ml、光照射劑量分別為0.125 J／cm2、0.25 J／cm2和0.5J／cm2的PDT組聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應。其中80 μ M的CX組，2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2的PDT組以及兩者的聯(lián)合處理組的抑制率分別為13.23％、28.34％和44.57％，聯(lián)合處理組與單獨處理

12、組相比，抑制率有顯著差異(P<0.05)；(2)對于HepG2細胞，40.96 μ M、51.2 μ M和64μM的塞來昔布與光敏劑濃度為2.5μg／ml、光照射劑量為0.25J／cm2的PDT組聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應。其中64 μM的CX組，2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2的PDT組以及兩者的聯(lián)合組的抑制率分別為17.17％、25.14％和44.87％，聯(lián)合處理組與單獨處理組相比，抑制率有顯著差異(p<0.05)。

13、2.HE染色光鏡觀察和Hoechst染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示80 μM或64 μM CX組、PDT組和CX+PDT組作用24h后CNE-2或HepG2細胞均發(fā)生明顯的形態(tài)變化，細胞呈凋亡或壞死樣改變，聯(lián)合處理組比單獨處理組更明顯。 3.流式細胞儀檢測凋亡率，結(jié)果顯示80 μM的CX聯(lián)合2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2 PDT組可誘導CNE-2細胞發(fā)生凋亡和壞死，細胞凋亡率可達55.6％；64μM的CX聯(lián)合2.5

14、 μg／ml HMME+0.25J／cm2 PDT組誘導HepG2細胞的凋亡率達50.8％。 4.免疫細胞學染色結(jié)果顯示對照組細胞CNE-2和HepG2均表達COX-2，HMME-PDT處理后未發(fā)現(xiàn)CNE-2和HepG2細胞COX-2表達的增強。塞來昔布組和聯(lián)合處理組COX-2的表達顯著下調(diào)。 5.流式細胞儀檢測線粒體膜電位，對于CNE-2細胞，80 μM CX、PDT及CX+PDT處理組作用6h后單獨CX和PDT組膜電

15、位均明顯下降，聯(lián)合組比單獨處理組下降更明顯。而HepG2細胞，64 μM的CX組作用6h后膜電位顯著下降，6h后PDT組輕微下降，聯(lián)合組比單獨CX組下降更明顯。 6.80μM或64μM CX、PDT及CX+PDT處理CNE-2或HepG2細胞后，caspase-3的表達不同程度的上調(diào)，以聯(lián)合用藥組最明顯。 結(jié)論： 1.塞來昔布和HMME-PDI單獨作用對CNE-2、HepG2細胞有明顯的增殖抑制作用，這種抑制作用