P53基因治療聯(lián)合塞來(lái)昔布及順鉑對(duì)肺癌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，為惡性腫瘤死亡的首要因素，對(duì)肺癌采用傳統(tǒng)治療包括化療、放療和手術(shù)方法總的5年生存率不到15﹪。近年來(lái)，隨著對(duì)腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子生物靶向治療已成為肺癌治療的重要方法。 研究表明，p53基因是重要的抑癌基因，它所編碼的p53蛋白在參與細(xì)胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。p53基因的突變或缺失導(dǎo)致細(xì)胞遺傳不穩(wěn)定和對(duì)化療及放射治療不敏感。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中p53基因的突變率

2、達(dá)50﹪-70﹪，即使在無(wú)p53基因突變的肺癌中，p53基因因?yàn)榻Y(jié)合了高水平的MDM2蛋白而無(wú)活性，或因其下游基因如抗凋亡基因Bcl-2家族使p53基因功能發(fā)生變化或無(wú)活性轉(zhuǎn)錄而出現(xiàn)功能性失活。在肺癌細(xì)胞中導(dǎo)入野生型p53基因能增加多種化療藥物的敏感性。 近來(lái)許多研究證據(jù)表明，環(huán)氧化酶(COX)-2是預(yù)防和治療多種腫瘤包括肺癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。COX-2的高表達(dá)見(jiàn)于超過(guò)90﹪的侵襲性肺癌。臨床前研究已顯示，選擇性COX-2抑制劑能抑

3、制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增加肺癌的化療敏感性。 p53基因及COX-2基因作為肺癌治療的新靶點(diǎn)，聯(lián)合兩種分子靶向藥物對(duì)肺癌的化療敏感性研究卻鮮有報(bào)道。本研究利用重組人p53腺病毒注射液將重組腺病毒載體所攜帶的野生型p53基因?qū)肴朔蜗侔┘?xì)胞株，并聯(lián)合選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布及肺癌常用化療藥物順鉑，觀察對(duì)人肺腺癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤的抑制作用，為p53基因治療與選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合化療用于肺癌臨床提供一定的理論依據(jù)。 第一

4、部分：重組人p53腺病毒注射液對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及化療敏感性研究目的探討重組人p53腺病毒注射液(今又生/Gendicine，Ad-p53)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及化療敏感性的影響。 方法將重組腺病毒載體所攜帶的野生型p53基因?qū)肴朔蜗侔┘?xì)胞株GLC-82(含突變型p53基因)及A549(含野生型p53基因)，并聯(lián)合應(yīng)用化療藥物順鉑，通過(guò)Westernblot法分析外源野生型p53基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)觀察對(duì)細(xì)胞

5、生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞周期、凋亡的影響。 結(jié)果通過(guò)Westernblot證實(shí)了外源p53基因能在GLC-82及A549細(xì)胞中高效表達(dá)。MTT法觀察到Ad-p53對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間依賴(lài)性、劑量依賴(lài)性效應(yīng)，100MOI的Ad-p53與順鉑(DDP)0.5mg/L聯(lián)合應(yīng)用后72h，對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率達(dá)(43.13±0.72)﹪，與單藥組相比，差異有顯著性(P＜0.001)；對(duì)GLC-82細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率達(dá)(63.73±0.92

6、)﹪，與單藥組相比，差異有顯著性(P＜0.001)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-p53與DDP聯(lián)合應(yīng)用能使細(xì)胞阻滯于G0-G1期，S期細(xì)胞比例明顯減少，引起的A549細(xì)胞凋亡率為(28.99±1.07)﹪，與單藥組相比，差異有顯著性(P＜0.001)；引起的GLC-82細(xì)胞凋亡率為(62.98±2.43)﹪，與單藥組相比，差異有顯著性(P＜0.001)。 結(jié)論Ad-p53能抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。

7、 第二部分：塞來(lái)昔布對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的增殖抑制、環(huán)氧化酶-2表達(dá)的影響和化療敏感性研究 目的探討選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布(celecoxib)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的增殖抑制、COX-2表達(dá)和化療敏感性的影響。 方法用MTT法檢測(cè)celecoxib單藥及聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549及GLC-82的增殖抑制，流式細(xì)胞術(shù)分析celecoxib聯(lián)合DDP對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響，Westernblot法分析

8、不同濃度celecoxib干預(yù)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)COX-2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果MTT法檢測(cè)顯示，celecoxib(0-100μmol/L)對(duì)肺腺癌A549及GLC-82細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間依賴(lài)性、劑量依賴(lài)性效應(yīng)，A549及GLC-82細(xì)胞celecoxib72h的IC50值為30.9μmol/L和133μmol/L。celecoxib12.5μmol/L與25μmol/L聯(lián)合DDP0.5mg/L作用72h時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制

9、率分別為(33.75±2.02)﹪和(49.64±2.19)﹪，對(duì)GLC-82細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(59.88±1.04)﹪和(59.97±0.23)﹪，聯(lián)合用藥組與單藥組相比差異均有顯著性(P＜0.001)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，celecoxib12.5μmol/L與25μmol/L聯(lián)合DDP0.5mg/L時(shí)，引起的A549細(xì)胞凋亡率分別為(6.49±0.88)﹪和(10.59±1.22)﹪，引起的GLC-82細(xì)胞凋亡率分別為(14

10、.39±1.11)﹪和(16.34±1.06)﹪，聯(lián)合用藥組的凋亡率均明顯高于單藥組(P＜0.001)。Westernblot法分析顯示，A549細(xì)胞及GLC-82細(xì)胞中COX-2蛋白都為高表達(dá)，celecoxib濃度超過(guò)100μmol/L時(shí)，COX-2蛋白的表達(dá)完全受到了抑制。 結(jié)論celecoxib對(duì)肺癌的抗腫瘤作用機(jī)制涉及到COX-2依賴(lài)性途徑。celecoxib能增加DDP的化療敏感性。 第三部分：p53基因治療

11、聯(lián)合塞來(lái)昔布及順鉑對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的作用及治療負(fù)瘤裸鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 目的探討p53基因治療聯(lián)合塞來(lái)昔布及順鉑提高肺癌療效的可能性和初步機(jī)制。 方法將重組腺病毒載體介導(dǎo)的野生型p53基因(Ad-p53)與選擇性COX-2抑制劑塞來(lái)昔布及化療藥物順鉑三者聯(lián)用，通過(guò)MTT法檢測(cè)對(duì)人肺腺癌A549及GLC-82細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡，Westernblot法分析治療前、后p53及COX-2蛋白的表達(dá)情況，以及裸

12、鼠皮下移植瘤的治療實(shí)驗(yàn)，觀察三藥聯(lián)合對(duì)肺癌的作用及可能機(jī)制。 結(jié)果MTT法檢測(cè)顯示，Ad-p53100MOI、celecoxib12.5umol/L及DDP0.5mg/L三藥聯(lián)合作用72h時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(53.39±1.81)﹪，與各單藥組及兩藥組相比差異有顯著性(P＜0.001)；對(duì)GLC-82細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(68.54±1.15)﹪，與各單藥組及兩藥組相比差異有顯著性(P＜0.001)。流式細(xì)胞儀分析顯

13、示，三藥聯(lián)合作用72h誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡率為(42.92±0.70)﹪，與相應(yīng)對(duì)照組、單藥組及兩藥聯(lián)合組比較差異有顯著性(P＜0.001)；誘導(dǎo)的GLC-82細(xì)胞凋亡率為(67.79±2.24)﹪，除與Ad-p53及DDP兩藥聯(lián)合作用72h誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)外，與相應(yīng)對(duì)照組、單藥組及其它兩藥聯(lián)合組比較差異有顯著性(P＜0.001)。Westernblot法分析顯示，外源野生型p53基因只在Ad-p53單

14、藥組及Ad-p53聯(lián)合用藥組中表達(dá)，表達(dá)外源野生型p53基因組的COX-2蛋白的表達(dá)受到了顯著抑制。裸鼠皮下移植瘤的治療實(shí)驗(yàn)中，Ad-p53與DDP兩藥聯(lián)合治療組的抑瘤效應(yīng)好于單藥治療組，Ad-p53與celecoxib及DDP三藥聯(lián)合治療組的抑瘤效應(yīng)最強(qiáng)，對(duì)GLC-82細(xì)胞及A549細(xì)胞移植瘤的抑瘤率分別為93.33﹪和88.72﹪，與相應(yīng)各對(duì)照組、單藥組及兩藥聯(lián)合組比較差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論Ad-p53基因治療