Corilagin對淤膽型肝炎炎癥通路干預(yù)機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分、柯里拉京（corilagin）抗炎作用機(jī)制的初步研究。 目的：柯里拉京（corilagin）是從葉下珠中提取的有效藥理成分。本研究探討柯里拉京（corilagin）對脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子和介質(zhì)的干預(yù)作用。 方法：MTT法檢測柯里拉京（corilagin）對RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)胞的最大無毒濃度，采用LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞瘤細(xì)

2、胞，同時用柯里拉京（corilagin）進(jìn)行干預(yù)，ELISA法檢測細(xì)胞上清中TNF-α，IL-1β，IL-6，Il-10的含量，Griess法檢測細(xì)胞上清液中的NO，Real-time PCR法檢測細(xì)胞中TNF-α，COX-2，iNOS，HO-1 mRNA的表達(dá)情況，Western-blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)COX-2和 HO-1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：MTT法顯示柯里拉京（corilagin）對RAW 264.7細(xì)胞株的最大無毒

3、濃度為0.5mg/L。LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)柯里拉京（corilagin）干預(yù)24小時后，細(xì)胞上清液中的TNF-α，IL-1β和IL-6水平明顯比模型組要低（p<0.01）。柯里拉京（corilagin）可以明顯降低經(jīng)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)COX-2蛋白的表達(dá)（p<0.01）?？吕锢╟orilagin）不僅可以明顯降低細(xì)胞上清液中一氧化氮的釋放（p<0.05），而且可以明顯下調(diào)細(xì)胞中一氧化氮合酶mRNA的表達(dá)

4、（p<0.05 or 0.01），并且對IL-10有抑制作用，可促進(jìn)HO-1基因和蛋白的表達(dá)（p<0.01）?？吕锢╟orilagin）可以明顯阻止LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NF-κB的核轉(zhuǎn)位（p<0.01）。 結(jié)論：柯里拉京（corilagin）對促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)TNF-α，IL-1β，IL-6，COX-2，NO均有不同程度的抑制作用，并可以阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，說明柯里拉京（corilagin）對炎癥的起

5、始階段有明顯的抑制作用。在炎癥的修復(fù)階段，柯里拉京（corilagin）對HO-1的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用，說明此成分有促進(jìn)炎癥恢復(fù)的功效?？吕锢╟orilagin）對IL-10有抑制作用的同時沒有地塞米松誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。總之，從本實驗可以看出，柯里拉京（corilagin）在對LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞分泌的炎性因子和介質(zhì)有不同程度的抑制作用，可以初步說明柯里拉京（corilagin）具有抗炎的作用。

6、 第二部分、柯里拉京（corilagin）抗乙肝病毒的作用研究。 目的：明確柯里拉京（corilagin）是否有抗乙肝病毒的作用。 方法：MTT法檢測柯里拉京（corilagin）對HepG2.2.15細(xì)胞的最大無毒濃度。采用柯里拉京（corilagin）干預(yù)HepG2.2.15細(xì)胞，實時熒光定量PCR法檢測細(xì)胞上清液中HBV-DNA的分泌量，EIA法檢測細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg。 結(jié)果：處理9d

7、后，80mg/L柯里拉京（corilagin）組OD值與正常HepG2.2.15細(xì)胞組相比有顯著性差異（p<0.05），9d時柯里拉京（corilagin）對HepG2.2.15細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為75.85mg/L。各實驗劑量的柯里拉京（corilagin）組分別在3d、6d、9d上清液中分泌的HBV-DNA與正常細(xì)胞組相比無顯著性差異（p>0.05）。各實驗劑量的柯里拉京（corilagin）組分別在3d、6d、9d分泌

8、的HBsAg與正常細(xì)胞組相比無顯著性差異（p>0.05）。各實驗劑量的柯里拉京（corilagin）組分別在3d、6d、9d分泌的HBeAg與正常細(xì)胞組相比無顯著性差異（p>0.05）。 結(jié)論：從結(jié)果來看，實驗濃度的柯里拉京（corilagin）對HepG2.2.15細(xì)胞沒有毒性，在此濃度作用下HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的量沒有受到明顯影響，說明柯里拉京（corilagin）沒有明顯的抗

9、乙肝病毒的作用. 第三部分、柯里拉京（corilagin）提取物對淤膽型肝炎炎癥通路干預(yù)機(jī)制的研究。 目的：研究葉下珠柯里拉京（Corilagin）提取物對肝內(nèi)膽汁淤積的干預(yù)作用。 方法：給予SD大鼠ANIT造成急性淤膽型肝炎的動物模型，采用葉下珠柯里拉京（Corilagin）提取物灌胃，以地塞米松和熊去氧膽酸（UDCA）作為對照，檢測肝功能，觀察動物生活質(zhì)量，病理切片檢測肝組織病理學(xué)變化，實時熒光定量PCR法檢

10、測核因子Egr-1，趨化因子CINC-1和MIP-2，western-blot法檢測粘附分子ICAM-1，免疫組織化學(xué)法檢測核因子NF-κB轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS表達(dá)，ELISA法檢測肝組織和血清中TNF-α和IL-6的水平，采用硝酸還原酶法檢測組織中一氧化氮（NO），硫代巴比妥酸比色法檢測組織中丙二醛（MDA），黃嘌呤氧化酶法檢測組織中超氧化物歧化酶（SOD），比色法檢測組織中髓過氧化物酶（MPO）。 結(jié)果：經(jīng)柯里拉

11、京（corilagin）處理的淤膽型肝炎大鼠的淤膽指數(shù)明顯降低，柯里拉京（corilagin）對AKP，γ－GT和TBA在高峰期或者消退期有作用，但對轉(zhuǎn)氨酶無明顯影響。對急性淤膽型肝炎動物模型的生存狀況也有明顯改善，對肝臟組織學(xué)變化起到降低損害強(qiáng)度和縮短進(jìn)程的作用。對核因子Egr-1和NF-κB在高峰期或消退期有作用，對趨化因子CINC-1和MIP-2在高峰期或消退期有明顯抑制作用，對粘附分子ICAM-1的表達(dá)有降低作用，對肝組織內(nèi)促炎

12、細(xì)胞因子TNF-α和IL-6有一定影響，對肝組織iNOS和NO的表達(dá)有明顯促進(jìn)的作用，對肝組織氧化應(yīng)激的指標(biāo)有明顯恢復(fù)作用。 UDCA在急性淤膽型肝炎時有保護(hù)細(xì)胞膜和促進(jìn)膽汁排泄，改善肝功能的作用，但出現(xiàn)的時間較晚，對急性淤膽型肝炎動物模型的生存狀況也有明顯改善，對肝臟組織學(xué)變化起到降低損害強(qiáng)度和延緩損害進(jìn)程的作用。對核轉(zhuǎn)錄因子Egr-1無明顯作用，但淤膽后期對NF-κB有一定抑制作用，對趨化因子CINC-1和MIP-2沒有明顯

13、抑制作用，對粘附分子ICAM-1的表達(dá)有一定的降低作用，對肝組織內(nèi)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6，以及血清TNF-α無明顯作用，僅后期對血清IL-6有一定影響，對肝組織iNOS有輕微的促進(jìn)表達(dá)作用，但不影響肝組織中的NO，對肝組織中中性粒細(xì)胞的聚集無明顯影響，對肝組織中氧化應(yīng)激的指標(biāo)也無明顯影響。 經(jīng)地塞米松處理的淤膽型肝炎大鼠的淤膽指數(shù)和堿性磷酸酶出現(xiàn)降低外，其他指標(biāo)如轉(zhuǎn)氨酶，γ－谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶和總膽汁酸均上升，說明地塞米松

14、導(dǎo)致的免疫抑制可能造成肝細(xì)胞的繼發(fā)性損傷。并且，地塞米松處理的大鼠生活質(zhì)量明顯變差，體重急劇下降，凝血功能失常，出現(xiàn)出血傾向，肝組織病理學(xué)改變明顯加重，對核因子Egr-1無影響，早期可以抑制NF-κB，中后期反而加重，甚至還有加強(qiáng)趨化因子CINC-1和MIP-2的作用，對粘附分子ICAM-1的表達(dá)也是早期抑制，中后期反而促進(jìn)，對iNOS和NO在上升期和消退期有一定作用，有阻止組織和血清TNF-α和血清IL-6達(dá)到高峰并促進(jìn)恢復(fù)的作用，對

15、MPO反而有促進(jìn)作用，但對氧化產(chǎn)物MDA和抗氧化酶SOD有一定的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論：柯里拉京（corilagin）對淤膽型肝炎的保護(hù)作用上，對肝細(xì)胞膜沒有明顯的保護(hù)作用，但對促進(jìn)膽紅素的排泄，緩解肝臟的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷方面均有不同程度的作用：以促進(jìn)膽紅素排泄，抑制白細(xì)胞向肝臟的募集和趨化，緩解肝臟的氧化應(yīng)激最為明顯，且在整個急性淤膽型肝炎的發(fā)展演變過程中，以發(fā)病的中后期效果最好，起到降低炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和加快炎癥反應(yīng)的過程，促