寒溫配伍虎杖-桂枝藥對(duì)干預(yù)急性痛風(fēng)炎癥中TLRs-MyD88分子信號(hào)通路機(jī)制研究.pdf

1、痛風(fēng)是由于嘌呤和(或)尿酸的持續(xù)代謝障礙或排泄減少，尿酸鹽結(jié)晶(monosodi—um urate，MSU)析出并沉積于組織、器官引起的一種疾病。痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但國(guó)內(nèi)外研究表明痛風(fēng)出現(xiàn)的炎癥發(fā)病機(jī)制與TLRS/MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。Toll受體（TLRs）是人體先天免疫系統(tǒng)的識(shí)別受體，可以識(shí)別病原相關(guān)分子模型（PAMPs)和損傷相關(guān)分子模型（DAMPs），主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、DCs和粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞

2、等。THP-1細(xì)胞是利用白血病患者血液中的單核細(xì)胞建立的細(xì)胞株，表達(dá)除TLR3以外的所有的TLRS受體，是體外研究人單核-巨噬細(xì)胞功能的良好替代細(xì)胞。尿酸鈉（MSU）可以被TLR2、TLR4特異性識(shí)別并介導(dǎo)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而調(diào)控炎癥反應(yīng)。
　　虎杖是臨床常用藥，藥用價(jià)值高，其來源于蓼科屬草本植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)的干燥根莖和根，具有較為廣泛的藥理活性，性苦寒，主要用于關(guān)節(jié)痹痛、濕熱

3、黃疸等疾病。虎杖苷是虎杖發(fā)揮作用的主要成分。桂枝是樟科喬木植物肉桂的干燥嫩枝，歸心、肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解表等功能，常用于風(fēng)熱感冒、血寒經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹通等癥狀。桂枝的主要含有揮發(fā)性類物、香豆素類、甾體類及其他不同類別的化學(xué)成分，桂皮醛是桂枝揮發(fā)油類成分中作用效果最佳的化合物。研究發(fā)現(xiàn)桂枝及其提取物能桂皮醛等能夠治療多種急性、慢性的炎癥反應(yīng)，有良好的抗炎、抗菌作用。中藥具有寒、熱、溫、涼四種不同的藥性。相反藥性配伍如寒熱藥性，寒溫藥性是中醫(yī)

4、藥理論現(xiàn)代研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，是中藥藥性理論的核心。本課題組前期研究表明：樂行痛風(fēng)克對(duì)臨床急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病人有著顯著改善作用，寒溫藥對(duì)虎杖-桂枝是樂行痛風(fēng)克方中的核心藥對(duì)，并且虎杖：桂枝為6:1為最佳配比。
　　基于以上我們已有的研究成果，在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察虎杖-桂枝藥對(duì)干預(yù)急性痛風(fēng)炎癥大鼠的作用，分析虎杖-桂枝藥對(duì)對(duì)TLRS/MyD88信號(hào)通路的影響。另外，本實(shí)驗(yàn)將以THP-1細(xì)胞炎癥模型為對(duì)象，分析虎杖苷、桂皮醛對(duì)TLRS/

5、MyD88信號(hào)通路的影響，深入探討虎杖-桂枝治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，以進(jìn)一步了解虎杖-桂枝治療痛風(fēng)的可能靶點(diǎn)。
　　1虎杖-桂枝對(duì)MSU誘導(dǎo)的大鼠急性痛風(fēng)炎癥中TLRs/MyD88信號(hào)通路影響
　　目的：
　　研究虎杖-桂枝藥對(duì)對(duì)大鼠急性痛風(fēng)炎癥TLRs/MyD88分子通路的影響，進(jìn)而探討其對(duì)痛風(fēng)的治療作用機(jī)制。
　　方法：
　　將雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分成6組，每組8只，分別是正常對(duì)照組、尿酸鈉

6、（MSU）模型組、陽(yáng)性藥秋水仙堿組（0.1g·kg-1）、虎杖-桂枝低、中、高劑量組(3.5g·kg-1，7g·kg-1，14g·kg-1。相當(dāng)于人體臨床劑量的1，2，4倍）。正常對(duì)照組和模型組大鼠灌以生理鹽水，其他各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃7天（每日1次）。第4天灌胃后1小時(shí)后模型組與各給藥組大鼠右后踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉（MSU）0.2 ml（25 mg·ml-1），同時(shí)正常對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)注射同體積的生理鹽水，觀察各組動(dòng)物造模后不同時(shí)間點(diǎn)

7、足趾容積變化；第7天灌胃1小時(shí)后取血，ELISA測(cè)定外周血血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的變化，熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞Toll受體2(TLR2)、Toll受體4(TLR4)及髓樣分化因子88(MyD88)的表達(dá)。取血后將大鼠處死，每只大鼠取其右后踝關(guān)節(jié)相同部位，切片作病理學(xué)觀察。結(jié)果與模型組比較，在2小時(shí)、6小時(shí)2個(gè)劑量的中藥藥對(duì)組可顯著性減小大鼠足趾容積（p<0.0

8、5），48小時(shí)、72小時(shí)3個(gè)劑量中藥藥對(duì)組足趾容積均顯著減小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。3個(gè)劑量的虎杖-桂枝藥對(duì)可以不同程度的減輕血管充血程度和減少關(guān)節(jié)滑膜炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)反應(yīng)。與模型組比較，3個(gè)劑量的虎杖-桂枝藥對(duì)可顯著減少IL-1β的含量（p<0.01)，促進(jìn)TGF-β的表達(dá)，但無顯著性差異；下調(diào)TLR2、TLR4及MyD88的基因的表達(dá)水平（p<0.05，p<0.01)，與陽(yáng)性組相比，中劑量的虎杖-桂枝對(duì)MyD88、TLR4表

9、達(dá)的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照藥秋水仙堿作用相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　虎杖-桂枝藥對(duì)干預(yù)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)劑量的虎杖-桂枝藥對(duì)均可不同程度下調(diào)TLR2、TLR4及MyD88的基因表達(dá)和減少IL-1β的含量緩解大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，并且中劑量（7g·kg-1）可能是虎杖-桂枝藥對(duì)發(fā)揮作用的最優(yōu)劑量。2虎杖苷、桂皮醛對(duì)MSU誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞急性痛風(fēng)炎癥TLRs/MyD88信號(hào)通路影響

10、r>　　目的：
　　研究虎杖苷、桂皮醛抑制MSU誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。
　　方法：
　　將THP-1細(xì)胞分為正常對(duì)照組、尿酸鈉（MSU）模型組、陽(yáng)性藥秋水仙堿組（2ug·mL-1）、虎杖苷組（15ug·mL-1）、桂皮醛組（5ug·mL-1）、虎杖苷-桂皮醛組（20ug·mL-1）。所有組別細(xì)胞5％CO2、37℃培養(yǎng)24h后，給藥組給予相應(yīng)的藥物，正常對(duì)照組和模型組用 DMSO補(bǔ)齊；2h后，除正常對(duì)照

11、組其余實(shí)驗(yàn)組給予終濃度100ug·mL-1的MSU，正常對(duì)照組用PBS補(bǔ)齊；細(xì)胞置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞上清液及余下細(xì)胞。ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液的腫瘤壞死因子 a（TNF-a）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）含量；熒光定量PCR檢測(cè)TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和TRIF基因表達(dá); Westernblotting檢測(cè)TLR2、TLR4、MyD88、TRIF蛋白的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：

12、>　　與空白組比較，模型組THP-1細(xì)胞上清液TNF-a、IL-1β顯著增加（p<0.01）；模型組的TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和TRIF基因、蛋白表達(dá)均顯著性增加（p<0.05，p<0.01)；與模型組相比，各給藥組均能顯著性降低THP-1細(xì)胞上清液TNF-a、IL-1β含量（p<0.01）；給藥組均可不同的程度的下調(diào)TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和TRIF基因表達(dá)（p<0.05，p<0.01)；虎杖苷組、

13、桂皮醛組、虎杖苷-桂皮醛組TLR2、TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)顯著性降低（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　THP-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，虎杖苷、桂皮醛、虎杖苷-桂皮醛均對(duì)可以顯著性降低MSU誘導(dǎo)的TNF-a、IL-1β含量和下調(diào)該信號(hào)通路的TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB和TRIF基因表達(dá)，抑制 TLR2、TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá)，提示虎杖苷、桂皮醛可能通過影響并抑制TLRs/MyD88通路發(fā)揮