基于TLRs-MyD88與NLRP3通路的桂枝芍藥知母湯治療大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：在探討桂枝芍藥知母湯（Guizhishaoyaozhimu Decoction,GD）治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（Gouty Arthritis，GA）相關(guān)理論基礎(chǔ)上，基于TLRs-MyD88及NLRP3炎性體( NACHT-LRR-PYD-containing proteins3 inflammasome)信號(hào)通路，以GA相關(guān)的受體、信號(hào)銜接蛋白、炎性因子為觀察指標(biāo)，用三個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察GD對(duì)尿酸鈉踝關(guān)節(jié)注射致GA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織及尿酸鈉混

2、懸液誘導(dǎo)的大鼠中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎性信號(hào)表達(dá)的影響，以期探明GD治療GA的抗炎作用機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)一采用尿酸鈉踝關(guān)節(jié)注射致GA大鼠模型方法，對(duì)比觀察秋水仙堿及GD給藥組對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中炎性信號(hào)因子TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、COX-2、TGF-β1、NF-κ

3、B表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)二、三采用細(xì)胞藥理學(xué)方法，對(duì)比觀察秋水仙堿及GD給藥組對(duì)尿酸鈉混懸液誘導(dǎo)的大鼠中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞炎性信號(hào)TLR-2、TLR-4、NLRP3、MyD88、ASC、Capase-12、IKK-β、IκB-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表達(dá)的影響。主要觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法如下：
　?、艑?shí)驗(yàn)一180只雄性SD大鼠隨機(jī)分配到3個(gè)實(shí)驗(yàn)，即關(guān)節(jié)滑膜IHC實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)、Westb

4、lot實(shí)驗(yàn)。各試驗(yàn)取大鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，即模型對(duì)照組、正常對(duì)照組、GD中、高、低劑量組（4，8，16 g?kg-1）、秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組（3×10-4g?kg-1）。實(shí)驗(yàn)組均灌胃給藥，正常與模型組給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)7天。第5天灌胃前，大鼠足踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉懸液誘導(dǎo)GA。取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織，IHC技術(shù)檢測(cè)受體TLR-2、TLR-4、NLRP3的表達(dá)，Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均

5、 IOD， WesternBlot法檢測(cè) MyD88、ASC、Capase-1、Capase-12、IKK-β、IκB-α、PPAR-γ信號(hào)蛋白表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法（ELISA）測(cè)定炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、COX-2、TGF-β1表達(dá)水平,DPI-ELISA方法檢測(cè)NF-κB活性。
　　⑵實(shí)驗(yàn)二、三大鼠30只，按體重隨機(jī)分為5組，每組6只， GD中、高、低劑量組（4，8，16 g?k

6、g-1）、秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組（3×10-4g?kg-1）均灌胃給藥，正常組給予等容積的蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7天。最后一次灌胃1 h后，所有大鼠乙醚麻醉，取血清備用。SD雄性大鼠各20只，參照文獻(xiàn)方法提取分離大鼠中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，接種培養(yǎng)。細(xì)胞試驗(yàn)分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組（不加受體抑制劑，加NLRP3受體抑制劑），每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均含6個(gè)組，正常對(duì)照組加入正常大鼠血清，模型對(duì)照組、中、高、低劑量組、秋水仙堿組全部滴加200μg〃L-1的尿酸鈉混

7、懸液造模，同時(shí)滴加含藥血清，臵于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，中性粒細(xì)胞孵育12 h取出，巨噬細(xì)胞孵育2 h取出。ELISA法測(cè)定炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8的表達(dá)，DPI-ELISA方法檢測(cè)NF-κB活性； WesternBlot法檢測(cè)MyD88、ASC、Capase-12、IKK-β、IκB-α信號(hào)銜接蛋白表達(dá)水平；RT-PCR法觀測(cè)TLR-2、TLR-4、NLRP3 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：

8、r>　?、艑?shí)驗(yàn)一造模72h后，大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLRs-MyD88信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中 TLR-2、TLR-4平均IOD值、MyD88、IKK-β、IL-2、COX-2、IL-10、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)；IκB-α、PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、GD中、高劑量(8，16 g〃kg－1)組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR-2

9、、TLR-4平均IOD值、MyD88、IL-2、COX-2、IL-10、NF-κB表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；GD中、高劑量組IκB-α、PPAR-γ、TGF-β1表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，GD各劑量組IKK-β無(wú)明顯變化。GD中、高劑量組對(duì)MyD88表達(dá)抑制作用明顯，秋水仙堿組比較有顯著差異(P＜0.05)。
　　大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP3炎性體信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中NLRP

10、3、ASC、Capase-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，Capase-12表達(dá)明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、GD中、高劑量組NLRP3、ASC、GD各劑量組Capase-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)，GD中、高劑量組Capase-12表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。GD中、高劑量組對(duì)Capase-12、TGF-β1表

11、達(dá)上調(diào)作用明顯高于秋水仙堿組(P＜0.05)。
　?、茖?shí)驗(yàn)二中性粒細(xì)胞孵育12 h后，細(xì)胞中TLRs-MyD88信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠中性粒細(xì)胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；IκB-α表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；不加受體抑制劑實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，秋水仙堿組及GD各

12、劑量組TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GD高劑量組NF-κB及秋水仙堿組S100A8表達(dá)均明顯降低( P<0.05)，GD高劑量組IκB-α、S100A8表達(dá)明顯升高(P<0.05)。TLR受體抑制劑明顯抑制了中性粒細(xì)胞的TLR-2、TLR-4 mRNA、IKK-β、IκB-α、IL-1β、IL-6、IL-8、NF-κB的表達(dá)。GD各劑量組中S100A8、IκB-α表

13、達(dá)量顯著高于秋水仙堿組(P＜0.05)。
　　中性粒細(xì)胞中NLRP3炎性體信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠中性粒細(xì)胞NLRP3 mRNA、ASC(不加NLRP3受體抑制劑組)、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Caspase-12表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，給藥各組NLRP3 mRNA、IL-1β、IL-6、TNF-α及秋水仙堿組、GD高劑量組ASC

14、、GD中、高劑量組NF-κB表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，GD中、高劑量組Caspase-12表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而秋水仙堿組Caspase-12表達(dá)無(wú)明顯變化；NLRP3受體抑制劑明顯減少了中性粒細(xì)胞NLRP3 mRNA,IL-1βIL-6、TNF-α的表達(dá)，但對(duì)NF-κB無(wú)明顯影響。GD中、高劑量組Caspase-12表達(dá)明顯升高，與秋水仙堿組比較有顯著差異(P＜0.05)。
　?、菍?shí)驗(yàn)三巨噬細(xì)胞孵育2 h后，細(xì)胞

15、中TLRs-MyD88信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠巨噬細(xì)胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、S100A8、NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；，IκB-α表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；不加受體抑制劑實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，給藥各組TLR-2、TLR-4 mRNA、MyD88、IKK-β及 GD高劑量組及秋水仙堿組 IL-1β、IL-6、

16、IL-8、TNF-α、NF-κB的表達(dá)均明顯降低( P<0.05)，GD高劑量組IκB-α、S100A8、TGF-β1表達(dá)明顯升高(P<0.05)。TLR受體抑制劑明顯減少了巨噬細(xì)胞中TLR-2、TLR-4 mRNA、IκB-α、IL-1β、IL-8、TGF-β1的表達(dá)。GD各劑量組中S100A8、IκB-α表達(dá)量顯著高于秋水仙堿組(P＜0.05)
　　巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性體信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)結(jié)果：細(xì)胞造模2 h后，與正常組

17、比較，模型組大鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3 mRNA、ASC、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；Caspase-12表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，給藥各組NLRP3 mRNA、TNF-α及GD高劑量組ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，GD中、高劑量組Caspase-12表達(dá)明顯升高(P<0.05)，且與秋水仙堿組比較有顯著差異(P＜0.05)。

18、NLRP3受體抑制劑明顯抑制了巨噬細(xì)胞 NLRP3 mRNA、ASC、Caspase-12、IL-1β的表達(dá)，但對(duì)NF-κB活性無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：三個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致表明：GD治療 GA的作用機(jī)制可能與降低TLR-2、TLR-4、NLRP3受體及 MyD88、ASC蛋白表達(dá)，增加 PPAR-γ、IκB-α表達(dá)，抑制IL-1β分化成熟及NF-κB活化，降低Toll-MyD88及NLRP3炎性體信號(hào)通路炎性因子表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果