桂枝芍藥知母湯抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)預(yù)測(cè)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　在中醫(yī)整體觀思想指導(dǎo)下，采用藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，探討桂枝芍藥知母湯(GSZD)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的潛在分子機(jī)制，為臨床合理用藥提供理論支撐和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步新藥研發(fā)及同類復(fù)方的研究提供方法學(xué)參考。
　　方法:
　　1、GSZD所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)預(yù)測(cè)
　　1.1、從臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫TCM Database@Taiwan收

2、集GSZD所含化學(xué)成分的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。
　　1.2、基于結(jié)構(gòu)相似性原理，利用Therapeutic Targets Database中的Drug similaritysearch工具，獲得與上述復(fù)方所含化學(xué)成分具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的已知藥物分子（結(jié)構(gòu)相似度標(biāo)準(zhǔn):similar～very similar, similar score＞0.85），并將其作為GSZD所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)分子。
　　2、GSZD所含中藥-候選靶標(biāo)-R

3、A相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)分析
　　2.1、已知抗RA靶標(biāo)分子的收集和整理
　　在DrugBank數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫和KEGG通路數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行已知抗RA靶標(biāo)分子的收集。
　　2.2、蛋白質(zhì)相互作用信息的收集和整理
　　2.3、GSZD所含中藥-候選靶標(biāo)分子網(wǎng)絡(luò)的建立和分析
　　2.4、GSZD-候選靶標(biāo)-RA相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)的建立和分析
　　3、整體實(shí)驗(yàn)
　　3.1、關(guān)節(jié)炎模型的建立
　

4、　選用健康雄性Lewis大鼠，6-7周齡，體重180-220g，尾根單次皮內(nèi)注射0.1ml/只完全弗式佐劑，建立佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant-Induced Arthritis，AIA)模型。
　　3.2、動(dòng)物分組、給藥和取材
　　雄性Lewis大鼠48只，取材時(shí)間點(diǎn)為造模后第21天，每組8只隨機(jī)分為6個(gè)組，組別如下:正常組，AIA組，低、中、高劑量GSZD治療組，甲氨喋呤(MTX)治療組。GSZD三個(gè)劑量為4.65，

5、9.30，18.60g/kg（分別相當(dāng)于臨床0.5倍、1倍、2倍等效劑量），甲氨喋呤劑量0.2mg/kg（相當(dāng)于臨床等倍劑量）。從造模當(dāng)天開始給藥，GSZD連續(xù)給藥，甲氨蝶呤每給藥3天，間歇1天。第21天處死動(dòng)物，取關(guān)節(jié)組織固定或放置低溫冰箱備用，分別用于后續(xù)的組織病理學(xué)檢測(cè)及蛋白印跡反應(yīng)。
　　3.3、關(guān)節(jié)炎評(píng)價(jià)
　　3.3.1、關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)
　　及時(shí)觀察并記錄各組大鼠臨床紅腫癥狀，采用雙盲法評(píng)價(jià)疾病的嚴(yán)重程度

6、，包括臨床積分、關(guān)節(jié)炎發(fā)病率、肢體累計(jì)率、首次發(fā)病時(shí)間四個(gè)指標(biāo)。臨床積分參照Cheryl L方法即四肢的總分（總分最多80分），踝關(guān)節(jié)大于1分或者掌關(guān)節(jié)大于1分算發(fā)病;發(fā)病率即發(fā)病數(shù)量與本組總數(shù)的比值;肢體累計(jì)率即發(fā)病肢體數(shù)與本組大鼠的總肢體數(shù)比值;起始發(fā)病時(shí)間即首次觀察到關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的時(shí)間。
　　3.3.2、關(guān)節(jié)炎大鼠受損組織的病理變化
　　采用HE染色法和甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)取材后的大鼠受損關(guān)節(jié)組織（踝關(guān)節(jié)）進(jìn)行染色，鏡下

7、觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化，觀察大鼠滑膜炎癥、軟骨損傷及骨破壞情況并采用雙盲法計(jì)分。
　　3.3.3、炎癥相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　采用western blot方法檢測(cè)取材后的大鼠受損踝關(guān)節(jié)中HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號(hào)軸中五個(gè)蛋白質(zhì)分子的表達(dá)情況，并利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　4、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　4.1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　選用RA患者成纖維滑膜細(xì)胞(HFLS-RA)，使用

8、滑膜細(xì)胞專用培養(yǎng)基(CellApplications公司，USA)加100U/mL青霉素，80U/mL鏈霉素，2mM谷氨酰胺及10％專用生長因子，在37℃、5％CO2、95％空氣的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為狀態(tài)良好的第4-8代細(xì)胞。
　　4.2、細(xì)胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù)
　　細(xì)胞長到約為80％時(shí)可用，除正常對(duì)照組外，其余組別的細(xì)胞均用10ng/mL白介素（IL-1β）誘導(dǎo)24h產(chǎn)生炎性因子。除正常組和誘導(dǎo)對(duì)照組外，其他組分別加

9、入不同濃度的GSZD（5.12×10-5，2.56×10-4，1.28×10-3μg/mL）。
　　4.3、炎癥相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)
　　體外培養(yǎng)的HFLS-RA給予不同干預(yù)條件后，采用western blot方法檢測(cè)HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號(hào)軸中五個(gè)蛋白質(zhì)分子的表達(dá)情況，并利用軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1、GSZD所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)譜
　　從臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫

10、TCM Database@Taiwan收集得到165個(gè)GSZD所含化學(xué)成分的二級(jí)結(jié)構(gòu)，基于結(jié)構(gòu)相似性原理預(yù)測(cè)得到該復(fù)方的77個(gè)候選靶標(biāo)，其中有15個(gè)是已知抗RA藥物、自身免疫性疾病治療藥物、以及鎮(zhèn)痛藥物的靶標(biāo)分子。
　　2、GSZD所含中藥-候選靶標(biāo)-RA相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)分析
　　2.1、共收集得到208個(gè)已知RA治療靶點(diǎn);
　　2.2、GSZD所含中藥-候選靶標(biāo)分子網(wǎng)絡(luò)的建立和分析
　　基于GSZD所含中藥及其對(duì)應(yīng)

11、候選靶標(biāo)分子的相互作用，建立“GSZD所含中藥-候選靶標(biāo)分子網(wǎng)絡(luò)”。通過共模塊化分析，該網(wǎng)絡(luò)被劃分為三個(gè)模塊，分別以桂枝、芍藥、知母為中心，其中第一個(gè)模塊以桂枝為中心，主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子合成及刺激反應(yīng)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān);第二個(gè)模塊以芍藥為中心，主要與藥物代謝和降低藥物毒性有關(guān);第三個(gè)模塊以知母為中心，與細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和G-蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。
　　2.3、GSZD所含中藥-候選靶標(biāo)-RA相關(guān)分子

12、網(wǎng)絡(luò)
　　(1)篩選到GSZD候選靶標(biāo)-已知抗RA靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的135個(gè)hub節(jié)點(diǎn);
　　(2)根據(jù)通路富集分析結(jié)果顯示，這些hub節(jié)點(diǎn)通過參與T細(xì)胞和B細(xì)胞受體通路、Toll-like受體通路、破骨細(xì)胞分化、NF-kappa B信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、趨化因子通路、VEGF通路和神經(jīng)反應(yīng)性配體和受體相互作用，進(jìn)而影響到RA進(jìn)展中的主要病理學(xué)改變?nèi)缪装Y、滑膜血管翳形成、炎細(xì)胞浸潤、血管新生、關(guān)節(jié)損傷和疼痛;
　

13、　(3)通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦档挠?jì)算，篩選到40個(gè)關(guān)鍵hub節(jié)點(diǎn)，其中有10個(gè)為GSZD的關(guān)鍵候選靶標(biāo);
　　(4)通過計(jì)算上述網(wǎng)絡(luò)中每條邊的邊介度值，發(fā)現(xiàn)HDAC1-HSP90AA1相互作用對(duì)的邊介度值最高(edge-betweenness=128.25)，說明該相互作用對(duì)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的媒介作用;
　　(5)發(fā)現(xiàn)有三個(gè)已知抗RA靶標(biāo)（NFKB2、IKBKB和TNF-α）與HDAC1-HSP90AA1發(fā)生直接相互作用，并形成

14、HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號(hào)軸;
　　(6)進(jìn)一步功能挖掘結(jié)果顯示，HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號(hào)軸主要參與抗原呈遞、T細(xì)胞和B細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll-like受體信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、破骨細(xì)胞分化、NF-kappa B信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果提示 GSZD可能通過調(diào)控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB

15、-TNF-α信號(hào)軸來矯正RA病程中失衡的“炎癥-免疫分子網(wǎng)絡(luò)”。
　　3、整體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
　　3.1、GSZD能緩解AIA大鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度
　　肉眼觀察AIA模型組的大鼠臨床紅腫、畸形癥狀明顯，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，AIA模型組的大鼠發(fā)病率為100％，臨床積分最高35分，平均首次發(fā)病時(shí)間為造模后第11天，肢體累計(jì)率為52％。GSZD給藥后可顯著改善AIA大鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，體現(xiàn)在降低關(guān)節(jié)臨床積分、發(fā)病率、肢體累計(jì)率，延長首次

16、發(fā)病時(shí)間。
　　3.2、GSZD對(duì)AIA大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的改善作用
　　HE染色和甲苯胺藍(lán)染色顯示，AIA模型組的大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，滑膜增生明顯，軟骨損傷和骨損壞明顯。GSZD可降低AIA大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分、軟骨破壞評(píng)分及骨破壞評(píng)分。
　　3.3、GSZD對(duì)HDA C1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號(hào)軸的調(diào)控作用
　　western blot方法檢測(cè)表明，與正常組相比，AI

17、A模型組的大鼠受損踝關(guān)節(jié)組織中HDAC1，HSP90AA1，NFKB2，IKBKB及TNF-α五種蛋白的表達(dá)均異常升高，GSZD能有效降低AIA大鼠踝關(guān)節(jié)中上述五種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　4、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
　　western blot方法檢測(cè)表明，與空白對(duì)照組相比，IL-1β誘導(dǎo)的HFLS-RA中HDAC1，HSP90AA1，NFKB2，IKBKB及TNF-α的蛋白表達(dá)均上調(diào)，GSZD能有效降低這五種蛋白的表達(dá)。

18、　　結(jié)論:
　　本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略，整合藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)、網(wǎng)絡(luò)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，闡釋GSZD治療RA的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GSZD具有改善RA病情、減輕RA癥狀的作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控HDAC1-HSP90AA1-NFKB2-IKBKB-TNF-α信號(hào)軸來矯正RA進(jìn)展中失衡的“炎癥-免疫分子網(wǎng)絡(luò)”。此項(xiàng)研究為GSZD在臨床治療RA中的合理運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為新藥研發(fā)及其他同類中藥復(fù)方的研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)