烏頭湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒證的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、目的:通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，將藥物靶標(biāo)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)分析和實驗驗證相結(jié)合，探討烏頭湯緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)寒證的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制。
　　方法:
　　1.數(shù)據(jù)收集與整理
　　1.1烏頭湯所含化學(xué)成分收集和整理:基于臺灣中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(TCMDatabase@Taiwan)收集已知的烏頭湯五味中藥所含的化學(xué)成分;
　　1.2已知RA相關(guān)基因收集和整理:基于DrugBank數(shù)據(jù)庫、

2、OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫和KEGG通路數(shù)據(jù)庫，收集已知RA相關(guān)基因;
　　1.3蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)收集和整理:蛋白質(zhì)相互作用信息來源于八個現(xiàn)有的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，分別為Human Annotated and Predicted ProteinInteraction Database(HAPPI)、 Reactome、 Online Predicted HumanInteraction Database(OPHID)、InA

3、ct、Human Protein Reference Database(HPRD)、Molecular interaction Database(MINT)、Database of InteractingProteins（DIP）和PDZBase。
　　2.烏頭湯候選靶標(biāo)預(yù)測:采用drug-CIPHER-CS軟件，基于化合物結(jié)構(gòu)相似性和功能相似性原理，預(yù)測烏頭湯所含化學(xué)成分的候選靶標(biāo)基因。
　　3.烏頭湯所含化學(xué)成分-預(yù)測靶

4、標(biāo)基因-已知RA相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析
　　3.1基于現(xiàn)有蛋白質(zhì)相互作用信息，提取烏頭湯候選靶標(biāo)基因與已知RA相關(guān)基因間已知RA相關(guān)基因的相互作用信息，并構(gòu)建藥物靶標(biāo)分子網(wǎng)絡(luò);
　　3.2網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值的計算:計算四種網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值節(jié)點連接度、介度、緊密度和K-core值，并選取其值大于相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點為關(guān)鍵hub節(jié)點。
　　4.通路富集分析:基于Biocarta數(shù)據(jù)庫，利用DAVID分析平臺，進行生物分子功

5、能和通路的富集分析。結(jié)合前期烏頭湯藥效動力學(xué)和尿代謝組學(xué)，以及通路功能調(diào)研，設(shè)計整體和細胞多層次實驗驗證。
　　5.整體實驗
　　5.1膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型的建立
　　5.1.1 CIA（膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎，Collagen-induced arthritis，CIA）關(guān)節(jié)炎模型的建立:按2mg·mL-1將牛Ⅱ型膠原加入0.1mol·L-1冰醋酸溶液中，4℃過夜。臨用前加入等體積不完全弗氏佐劑，用組織勻漿機充分乳化，以滴

6、入水中呈珠狀為度，得到終濃度為1mg·mL-1的膠原乳劑，即配即用。于雄性SD大鼠（斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬状笫螅琒prague-Dawley Rat，SD大鼠）尾根部2～3cm處皮內(nèi)注射膠原乳化劑，第7天(D7)激活免疫;
　　5.1.2 CIA寒/熱性關(guān)節(jié)炎模型的建立:在復(fù)制CIA模型的同時，模擬類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎致病原因，分別施加外界風(fēng)寒濕（風(fēng)速6 m/s，相對濕度均為60％，溫度為6℃，連續(xù)21天）、風(fēng)濕熱（風(fēng)速6 m/s，相對濕度均為

7、90％，溫度為37℃，連續(xù)21天）條件刺激，造成CIA寒性和CIA熱性模型。
　　5.2實驗動物分組和給藥:雄性SD大鼠60只，隨機分為10個組，每組6只，組別如下:正常組、CIA模型組、CIA寒性模型組、CIA寒性模型組+烏頭湯（低、中、高治療劑量組）、CIA熱性模型組、CIA熱性模型組+烏頭湯（低、中、高治療劑量組）。其中，烏頭湯低、中、高治療劑量組的濃度1.88，3.75，7.5 g/kg，分別相當(dāng)于0.5倍、1倍、2倍臨床

8、劑量和臨床等倍劑量。大鼠給藥容積按照1mL/100g體重灌胃，從免疫當(dāng)天開始給藥，烏頭湯每給藥6天，間歇1天。給藥至免疫第22天，同時，正常對照組和模型組灌服等容積蒸餾水。造模后第23天進行動物取材。
　　5.3關(guān)節(jié)炎評價
　　5.3.1疾病嚴(yán)重度指標(biāo)評價:觀察并記錄各組大鼠的疾病嚴(yán)重情況（疾病發(fā)生率、關(guān)節(jié)炎臨床評分、受累關(guān)節(jié)比例和首次發(fā)病時間）。疾病發(fā)生率:每組中發(fā)病大鼠的只數(shù)/大鼠總只數(shù)的比例;關(guān)節(jié)炎臨床評分:自免疫8天

9、開始，參考文獻每2～3天進行一次臨床積分（雙人目測），計算出臨床積分，每足20分制，共80分;受累關(guān)節(jié)比例:每組中受累關(guān)節(jié)的只數(shù)/總關(guān)節(jié)只數(shù)的比例;首次發(fā)病時間:每日觀察各組大鼠發(fā)病情況，并記錄開始發(fā)病時間。采用Elisa（酶聯(lián)免疫吸附試驗，Enzyme-linked immunoabsorbent assay，Elisa）法檢測各組動物血清IgG和IgM的表達量;
　　5.3.2病證結(jié)合指標(biāo)評價:觀察并記錄各組大鼠的病證結(jié)合指標(biāo)

10、情況（關(guān)節(jié)表面溫度和血流量）。從發(fā)病第一天開始，通過紅外熱像儀測量雄性SD大鼠左足的關(guān)節(jié)表面溫度，每天測量一次。在免疫第22天，通過激光多普勒血流儀測量雄性SD大鼠左足的血流量。
　　6.體外細胞實驗
　　6.1細胞培養(yǎng):HFLS-RA(人成纖維滑膜細胞，Human Fibroblast likeSynoviocytes，HFLS-RA)按常規(guī)培養(yǎng)于含2mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、80 U/mL鏈霉素、10％FBS

11、（胎牛血清，F(xiàn)etal calf serum，F(xiàn)BS）及10％生長因子的滑膜細胞專用培養(yǎng)基中，置37℃、5％ CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);
　　6.2細胞誘導(dǎo)及藥物干預(yù):在體外實驗驗證中，HFLS-RA的代數(shù)均4代到8代，通過10 ng/mL的IL-1β（白介素-1β，Interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)后，由不同濃度的烏頭湯（0.1，0.2和0.4μ g/mL）作用24小時，再進行體外驗證。
　　7.相關(guān)蛋白表

12、達水平檢測:采用Western blot法檢測各組動物關(guān)節(jié)軟骨中和體外培養(yǎng)HFLS-RA中的NCOA1(核受體輔助活化因子1，Nuclear receptorcoactivator1，NCOA1)、NCOA2(核受體輔助活化因子2，Nuclear receptorcoactivator2，NCOA2)、 RXR-α(類視黃酉享X受體-α，Retinoid X Receptor-α，RXR-α)、PPAR-γ(過氧化物酶體增殖物活化受體γ

13、，Peroxisomeproliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)、CBP（轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，cyclic AMP response element binding protein，CBP）和MED1（介質(zhì)復(fù)雜亞基1，Mediator complex subunit1，MED1）的蛋白質(zhì)表達量。
　　結(jié)果:
　　1.烏頭湯緩解寒性RA的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)預(yù)測
　　1.1

14、構(gòu)建烏頭湯所含化學(xué)成分-預(yù)測靶標(biāo)基因-已知RA相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。此網(wǎng)絡(luò)包含254個節(jié)點，由烏頭湯中所含五味中藥、218個候選靶標(biāo)和31個已知RA相關(guān)基因構(gòu)成;
　　1.2計算節(jié)點連接度、介度、緊密度和K core值四個拓撲特征值。篩選所得節(jié)點拓撲特征值大于相應(yīng)中位值的即為關(guān)鍵節(jié)點（它們的中位值分別為5.00，0.30，8.13和4.00）。得到74個關(guān)鍵hub節(jié)點，其中有61個是烏頭湯關(guān)鍵候選靶標(biāo)，13個是已知抗RA靶標(biāo);

15、r>　　2.關(guān)鍵節(jié)點通路富集分析:烏頭湯所含化學(xué)成分-預(yù)測靶標(biāo)基因-已知RA相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點顯著富集于Role of PPAR-γ Coactivators inObesity and Thermogenesis, Chaperones modulate interferon SignalingPathway和NF-κ B activation三條通路。結(jié)合前期烏頭湯代謝組學(xué)研究和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，推測產(chǎn)熱PPAR-γ共激活

16、因子可能是烏頭湯治療RA寒證的潛在靶點之一。
　　3.整體實驗驗證
　　3.1烏頭湯能緩解CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度:從表征上看，CIA、CIA寒性和CIA熱性模型組大鼠紅腫、畸形癥狀表現(xiàn)明顯，烏頭湯作用后可顯著改善CIA寒性組大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀，具體表現(xiàn)為降低CIA寒性組大鼠的關(guān)節(jié)炎臨床積分、肢體累計率、發(fā)病率，以及推遲首次發(fā)病時間，而對CIA熱性組大鼠的癥狀改善情況不明顯。烏頭湯給藥后可顯著降低CIA寒性組的IgG和IgM

17、水平，以及CIA熱性大鼠血清中IgG水平;
　　3.2烏頭湯能改善CIA病證結(jié)合模型大鼠的相關(guān)指標(biāo):與空白組相比，CIA組、CIA寒性組和CIA熱性組的關(guān)節(jié)表面溫度和血流量顯著上升，烏頭湯可有效下調(diào)CIA寒性組的關(guān)節(jié)表面溫度，輕微增加CIA寒性組和CIA熱性組的關(guān)節(jié)血流量;
　　3.3烏頭湯對PPAR-γ共激活因子產(chǎn)熱通路中主要成分的調(diào)控作用:Westernblot檢測表明，與空白組相比，CIA組、CIA寒性組和CIA熱性組

18、炎癥關(guān)節(jié)中NCOA1、NCOA2、RXR-α、CBP、PPAR-γ和MED1六種蛋白的表達水平均顯著降低，烏頭湯作用后，CIA寒性組的PPAR-γ、RXR-α、MED1和NCOA2蛋白表達水平呈濃度依賴性增加。中(3.75g/kg·day)、高(7.5g/kg·day)劑量的烏頭湯可促進CIA寒性組中NCOA2和CBP的表達。烏頭湯在CIA熱性組中對六種蛋白的調(diào)節(jié)作用較對CIA寒性組的作用弱。
　　4.體外細胞實驗驗證:Weste

19、rn blot檢測表明，與空白組相比，IL-1β誘導(dǎo)的HFLS-RA中NCOA1、NCOA2、RXR-α、CBP、PPAR-γ和MED1六種中蛋白的表達水平均下調(diào)，烏頭湯可有效升高以上六種蛋白的表達。
　　小結(jié):本研究通過將藥物靶標(biāo)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)分析和實驗驗證相結(jié)合的方法，探討了中醫(yī)經(jīng)典方劑烏頭湯治療RA寒證的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機制，相關(guān)研究結(jié)論如下:
　　(1)在本課題組前期建立起來的較完善的藥物靶標(biāo)預(yù)測方法的基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建烏頭湯所

20、含化學(xué)成分-預(yù)測靶標(biāo)分子-已知RA相關(guān)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，選到74個關(guān)鍵hub節(jié)點，其中有61個是烏頭湯關(guān)鍵候選靶標(biāo)，13個是已知抗RA靶標(biāo)。通路富集分析顯示，這些關(guān)鍵節(jié)點顯著富集于Role of PPAR-γCoactivators in Obesity and Thermogenesis, Chaperones modulate interferonSignaling Pathway和NF-κ B activation通足各中;

21、>　　(2)結(jié)合前期烏頭湯藥效動力學(xué)和尿代謝組學(xué)研究，以及PPAR-γ共激活因子產(chǎn)熱通路功能，發(fā)現(xiàn)烏頭湯對寒性RA的治療作用與其對涉及到此通路的六個關(guān)鍵節(jié)點（PPAR-γ、NCOA1、NCOA2、MED1、RXRA和CREBBP）的調(diào)控有關(guān);
　　(3)通過實驗驗證，烏頭湯對RA寒性的疾病改善作用較RA熱性的改善作用顯著，且呈劑量依賴性（1.88g/kg-7.5g/kg）。具體表現(xiàn)為降低CIA寒性關(guān)節(jié)炎臨床積分、疾病發(fā)生率、受累關(guān)

22、節(jié)比例，推遲首次發(fā)病時間。烏頭湯給藥后可顯著降低CIA寒性組的IgG和IgM水平，以及CIA熱性大鼠血清中IgG水平，并能降低CIA寒性組大鼠的關(guān)節(jié)表面溫度，增加其關(guān)節(jié)表面血流量;
　　(4)整體和細胞實驗揭示烏頭湯對CIA寒性組的PPAR-γ、NCOA1、NCOA2、MED1、RXRA和CREBBP蛋白表達水平有促進作用，而在CIA熱性組中對六種蛋白的調(diào)節(jié)作用較對CIA寒性組的作用弱。
　　結(jié)論:PPAR-γ共激活因子產(chǎn)熱