HER2-neu-IL12融合基因疫苗的構(gòu)建及其對小鼠乳腺癌的預(yù)防和治療作用.pdf

1、目的：(1)構(gòu)建人表皮生長因子受體(HER2/neu)胞外區(qū)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA6-HER2/neu）；轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞(EMT6)，獲得其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株(EMT6/HER2/neu)。(2)構(gòu)建HER2neu、IL12融合基因重組核酸疫苗pcDNA6-HER2/neu-IL12。(3)將該疫苗在HER2/neu陽性乳腺癌小鼠體內(nèi)應(yīng)用，探討其預(yù)防和治療作用。 方法：(1)HER2/neu重組質(zhì)粒的構(gòu)建：用PCR從含H

2、ER2/neu全長基因的pcDNA3.1-HER2/neu質(zhì)粒上擴(kuò)增HER2/neu胞外區(qū)(ECD)基因片段；經(jīng)酶切、連接構(gòu)建pcDNA6-HER2/neu，通過酶切及測序鑒定；(2)建立HER2/neu陽性小鼠乳腺癌細(xì)胞株（EMT6/HER2/neu）：以PEI法將pcDNA6-HER2/neu導(dǎo)入小鼠乳腺癌細(xì)胞(EMT6)中，經(jīng)殺稻瘟菌素(Blasticidin)篩選，獲得抗性克隆EMT6/HER2/neu；用RT-PCR檢測EMT

3、6/HER2/neu中HER2/neu mRNA，免疫組化法檢測其HER2/neu蛋白的表達(dá)。(3)pcDNA6-HER2/neu-IL12的構(gòu)建：用PCR方法從pcDNA6-IL12質(zhì)粒上擴(kuò)增IL12序列；同樣進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選；將其插入pcDNA6-HER2/neu質(zhì)粒中HER2/neu基因下游，獲得pcDNA6-HER2/neu-IL12；對其進(jìn)行酶切及測序鑒定。(4)pcDNA6-HER2/neu-IL12對HER2/n

4、eu陽性小鼠乳腺癌的防治作用：①預(yù)防組：選6-8周體重16-18g昆明種小鼠30只，隨機(jī)分成5組。Ⅰ組：pcDNA6-HER2/neu組；Ⅱ組：pcDNA6-IL12組；Ⅲ組：pcDNA6-HER2/neu+pcDNA6-IL12組；Ⅳ組：pcDNA6-HER2/neu-IL12組；Ⅴ組：生理鹽水組。各組小鼠每隔兩周在其股四頭肌注射相應(yīng)質(zhì)粒(1ug/ul)或生理鹽水50υl，共免疫3次。于最后免疫兩周后在小鼠右胸皮下接種EMT6/HER

5、2/neu細(xì)胞（2×106個/ml，100υl/只），分別于第7、10、14、17、20、24天測量腫瘤大小，第24天處死小鼠，剝?nèi)×鲶w、脾臟并稱重；分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，分別檢測其特異性淋巴細(xì)胞增生反應(yīng)（MIT法）、淋巴細(xì)胞殺傷活性( LDH釋放法)和特異性IFN-γ釋放(ELISA)等細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)。②治療組：另選6-8周體重16-18g昆明種小鼠30只，分組方法同預(yù)防組（命名為A、B、C、D和E）。全部小鼠于右胸皮下接種EMT6/H

6、ER2/neu細(xì)胞（2x106個/ml，100ul/只）致瘤，分別于第7、10、14、17、20天給予瘤內(nèi)注射相應(yīng)質(zhì)粒(1ug/ul)或生理鹽水100ul，并測量腫瘤大小，第24天處死小鼠，檢測的免疫學(xué)指標(biāo)同預(yù)防組。 結(jié)果：(1)HER2/neu PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(1896bp)； pcDNA6-HER2/neu經(jīng)酶切、瓊脂糖凝膠電泳后，可見與PCR產(chǎn)物大小相同的片段；DNA測序結(jié)果顯示，pcDNA6-HER2/neu中

7、HER2/neu基因序列無誤，讀框正確。(2)用RT-PCR可在EMT6/HER2/neu中檢測到HER2/neu mRNA；經(jīng)免疫組化染色證實(shí)，EMT6/HER2/neu中有HER2/neu的陽性信號。(3)對pcDNA6-HER2/neu-IL12融合基因重組質(zhì)粒的酶切及測序結(jié)果表明，HER2/neu和IL12兩段基因序列無誤，連接方向及讀框正確。(4)動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用HER2/neu和IL12基因疫苗或二者聯(lián)合應(yīng)用對HE

8、R2/neu陽性乳腺癌(預(yù)防組Ⅰ-Ⅳ；治療組A-D)均獲得顯著的預(yù)防和治療作用；而應(yīng)用pcDNA6-HER2/neu-IL12表現(xiàn)更為強(qiáng)大的抗腫瘤作用；多項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，pcDNA6-HER2/neu-IL12可顯著提高實(shí)驗(yàn)小鼠特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫力。pcDNA6-HER2/neu-IL-12的抗腫瘤效應(yīng)與pcDNA6-HER2/neu和pcDNA6-IL12聯(lián)合應(yīng)用組相當(dāng)。該融合基因疫苗比兩種重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用具有易制備、使用