Her2-ScFv導(dǎo)向的RNAi對Her-2陽性乳腺癌治療的研究.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文Her2ScFv導(dǎo)向的RNAi對Her2陽性乳腺癌治療的研究姓名：姚燕丹申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：宋爾衛(wèi)20090605白導(dǎo)向RNAi的能力和基因沉默作用，并觀察其抗腫瘤效應(yīng)。研究方法：構(gòu)建用于表達F5P融合蛋白的質(zhì)粒后，通過昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)染、表達、純化和鑒定融合蛋白。隨后用動態(tài)光散射和Gelshiftassay方法評價F5P融合蛋白與核酸物質(zhì)結(jié)合的能力。在體外用流式細胞檢測技術(shù)和共聚焦

2、顯微鏡技術(shù)評價F5P融合蛋白能否把熒光標記的siRNA輸送到Her2陽性的乳腺癌細胞；隨后在體內(nèi)用小動物成像系統(tǒng)和腫瘤冰凍切片評價F5P融合蛋白把熒光標記的siRNA輸送到體內(nèi)后在腫瘤區(qū)域的分布。用F5P融合蛋白輸送PLKlsiRNA處理Her2陽性乳腺癌細胞，并用RTPCR、Westernblot和RealtimePCR評價靶基因的mRNA和蛋白的表達水平；接著用3H胸腺嘧啶核苷、MTT、球囊形成能力和多種檢測凋亡的方法評價F5P融合

3、蛋白靶向輸送siRNA治療后對增殖的抑制和對凋亡的誘導(dǎo)作用。在體內(nèi)通過尾靜脈注射F5P融合蛋白和PLKlsiI冰A進行靶向治療Her2陽性乳腺癌原位移植模型和轉(zhuǎn)移模型，并測量和繪制腫瘤生長曲線和生存曲線、腫瘤組織切片免疫組化增殖和凋亡染色以及小動物成像系統(tǒng)和RealtimePCR等進行療效綜合評價。研究結(jié)果：1成功構(gòu)建pACgp67BHer2一ScFvProtamine質(zhì)粒，并經(jīng)過昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)進行表達；檢測顯示在咪唑濃度為2

4、50mM的條件下洗脫時所獲得的融合蛋白純度較高。2動態(tài)光散射和Gelshiftassay檢測顯示融合蛋白能夠與核酸物質(zhì)結(jié)合，而且結(jié)合siRNA后顆粒大小沒有明顯的改變。3用流式細胞檢測技術(shù)和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測顯示F5P融合蛋白能夠把FAMsiRNA輸送到Her2陽性的乳腺癌細胞內(nèi)。小動物成像系統(tǒng)和腫瘤冰凍切片也同樣顯示F5P融合蛋白把FAMsiRNA輸送到Her2陽性的乳腺癌腫瘤。4F5P融合蛋白靶向輸送PLKIsiRNA到Her2陽