17β-雌二醇通過整聯(lián)蛋白α1β1和α2β1抗大鼠髓核細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的:探索胞膜整聯(lián)蛋白α1β1、α2β1參與的17β-雌二醇抗大鼠腰椎間盤細胞凋亡的作用機制。
　　方法:酶消化法原代培養(yǎng)大鼠髓核細胞，貼壁細胞融合為單層時，用含EDTA的0.2％的胰酶消化傳代.細胞生長至第3代時，用不含胎牛血清、不含酚紅的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，按以下分組實驗，每組均為6個樣本。對照組:加入少量乙醇作為對照;雌激素組:加入17β-雌二醇干預;雌激素+抑制劑組:加入17β-雌二醇和雌激素受體(ER)抑制劑IC

2、I182780干預。細胞培養(yǎng)48小時后，應用:(1)免疫細胞化學法行Ⅱ型膠原染色鑒定髓核細胞;(2)行流式細胞術以及TUNEL法檢測細胞凋亡;(3)細胞-膠原粘附實驗檢測細胞與Ⅰ、Ⅱ型膠原的粘附水平;(4)western印跡法對整聯(lián)蛋白亞基α1，α2，β1定量檢測。
　　結果:(1)原代腰椎髓核細胞呈多角形或長梭形，輪廓清楚，細胞核呈圓形或橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)可見分泌顆粒，24～48 h細胞貼壁，7～8 d細胞進入對數(shù)生長期，可傳6～8

3、代，并分泌Ⅱ型膠原。(2)免疫細胞化學檢測到髓核細胞Ⅱ型膠原呈陽性，髓核細胞純度較高。(3) TUNEL法檢測到雌激素可以有效地降低髓核細胞凋亡發(fā)生率;流式細胞術檢測:髓核細胞早期凋亡率:對照組為4.00％±0.16％;雌激素組為0.41％±0.19％;雌激素+抑制劑組為3.20％±0.05％。細胞晚期凋亡率:對照組為2.01％±0.18％;雌激素組為0.50％±0.10％;雌激素+抑制劑組為2.63％±0.20％。各組細胞凋亡率的差異

4、有統(tǒng)計學意義（F=24.20，P＜0.001）。雌激素組凋亡率低于對照組(P＜0.01)和雌激素+抑制劑組(P＜0.01)，對照組與雌激素+抑制劑組差異無統(tǒng)計學意義。(4)細胞與Ⅱ型膠原粘附實驗:各組OD值（吸光度）:對照組為0.60±0.03，95％CI(0.53，0.68);雌激素組為0.73±0.04，95％CI(0.63，0.83)，雌激素+抑制劑組為0.55±0.07，95％CI(0.37，0.73)。各組細胞對Ⅰ型膠原的粘附

5、水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，對Ⅱ型膠原的粘附水平差異有統(tǒng)計學意義(F=10.68，P＜0.05)，雌激素組高于對照組（P＜0.05）和雌激素+抑制劑組(P＜0.001)，對照組與雌激素+抑制劑組差異無統(tǒng)計學意義。(5)整聯(lián)蛋白α2亞基條帶的相對灰度值(/β-actin):對照組為0.23±0.005，95％CI(0.22，0.24);雌激素組為0.51±0.019，95％CI(0.46，0.55);雌激素+抑制劑組為0.21±

6、0.009，95％CI(0.18，0.23)。整聯(lián)蛋白β1亞基條帶的相對灰度值(/β-actin):對照組為0.26±0.011，95％CI(0.24，0.29);雌激素組為0.50±0.031，95％CI(0.43，0.58);雌激素+抑制劑組為0.25±0.018，95％CI(0.20，0.29)。整聯(lián)蛋白α1亞基表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。α2和β1亞基表達水平均有統(tǒng)計學差異，雌激素組高于對照組(P＜0.01)和雌激