FSH和17β-雌二醇聯(lián)合作用調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞Skp2表達(dá)的機(jī)制.pdf

1、睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cell，SC)是曲細(xì)精管上皮中一種非常重要的功能細(xì)胞，為生精細(xì)胞的分化成熟提供激素、脂類、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)；與生精細(xì)胞構(gòu)成睪丸曲細(xì)精管的主要組織結(jié)構(gòu)。SC的功能主要受下丘腦-垂體-性腺軸的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，血睪屏障功能使生精細(xì)胞受到良好的保護(hù)。睪丸支持細(xì)胞能支持生精細(xì)胞的數(shù)量是有限的，因此睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量在一定程度上決定了睪丸產(chǎn)生精子的數(shù)量。
　　 FSH在0-50ng/ml的濃度能以劑量依賴的方

2、式促進(jìn)睪丸支持細(xì)胞增殖，但當(dāng)FSH濃度過高時(shí)，F(xiàn)SH的促增殖作用有所下降；17β-雌二醇在培養(yǎng)條件下能促進(jìn)未成熟的大鼠或仔豬支持細(xì)胞增殖，并且它們都與cAMP、ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)，但FSH和17β-雌二醇聯(lián)合作用時(shí)如何調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件下未成熟仔豬睪丸支持細(xì)胞中Skp2的表達(dá)并不清楚。因此，本研究以體外培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細(xì)胞為研究對(duì)象，通過添加各種信號(hào)通路的抑制劑，應(yīng)用Western Blottingting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，

3、檢測(cè)Skp2蛋白和mRNA在FSH和17β-雌二醇聯(lián)合調(diào)節(jié)支持細(xì)胞增殖中的的表達(dá)，以闡明FSH和雌激素聯(lián)合作用時(shí)通過何種信號(hào)通路調(diào)節(jié)Skp2的表達(dá)，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)睪丸支持細(xì)胞增殖的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)以仔豬為研究對(duì)象，用FSH(50ng/ml)和17β-雌二醇(10-9mol/L)聯(lián)合處理支持細(xì)胞0min、15min、30min、60min、90min后，收集細(xì)胞提取蛋白和RNA，用Western blotting檢測(cè)

4、Skp2的表達(dá)量，用熒光定量PCR檢測(cè)Skp2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH和17β-雌二醇共同作用促進(jìn)了Skp2蛋白的表達(dá)，30min時(shí)，蛋白的量最大，此后Skp2蛋白的表達(dá)有所下降，到90min時(shí)，Skp2蛋白的表達(dá)量與對(duì)照相比無顯著差異；FSH和17β-雌二醇共同作用15min后，Skp2 mRNA的表達(dá)量增加了1.93倍(P<0.05)，到30min時(shí)，Skp2 mRNA的表達(dá)量最大，與對(duì)照相比，增加了7.39倍(P<0.0

5、5)，此后Skp2的表達(dá)有所下降，到90min時(shí)，Skp2 mRNA的表達(dá)量降為對(duì)照組的3.06倍(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)證明FSH和17β-雌二醇共同作用可以促進(jìn)Skp2蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究了cAMP、PKA、Ca2+和ERK對(duì)FSH和17β-雌二醇聯(lián)合作用誘導(dǎo)Skp2表達(dá)的影響。加入cAMP的促進(jìn)劑Forskolin促進(jìn)了Skp2蛋白的表達(dá)，但其促進(jìn)作用弱于FSH或17β-雌二醇的作用。分別加入環(huán)磷酸腺

6、苷抑制劑(Rp-cAMP)、蛋白激酶A(PKA)抑制劑(H-89)、L-Ca2+離子通道抑制劑(Verapamil)和ERK1/2抑制劑(U0126)時(shí)，它們都抑制了FSH和17β-雌二醇共同誘導(dǎo)的Skp2蛋白的表達(dá)；并且Forskolin明顯促進(jìn)了Skp2 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照相比增加了8.98倍(P<0.05)，但略低于FSH或17β-雌二醇的作用(P>0.05)。Rp-cAMP、H-89、Verapamil、U0126都影響了F

7、SH和17β-雌二醇共同作用時(shí)Skp2 mRNA的表達(dá)，Skp2 mRNA的表達(dá)水平與FSH和17β-雌二醇共同作用相比分別下降了50.66％、53.96％、51.46％、57.97％(P<0.05)。
　　 本實(shí)驗(yàn)還分析了PKA、Ca2+對(duì)ERK1/2在支持細(xì)胞內(nèi)活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，F(xiàn)SH和17β-雌二醇共同作用增強(qiáng)了ERK1/2的活性，但效果與FSH和17β-雌二醇單獨(dú)作用相比無明顯差異。H-89、Verapa