Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中對水通道蛋白AQP1調(diào)控作用的研究.pdf

1、本研究共分兩個部分 第一部分： 研究背景和目的： Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在脊椎動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起至關(guān)重要作用的一條信號通路，其在胚胎早期可以通過通路各組分不同時間、空間的特異性表達對多種細胞的命運決定產(chǎn)生影響，并且可以與Wnt、FGFs、BMPs等信號通路產(chǎn)生相互作用來實現(xiàn)不同細胞定向分化的精細調(diào)節(jié)。Hedgehog信號的調(diào)節(jié)紊亂在胚胎期會造成神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙和畸形，在已經(jīng)成熟的個體則會

2、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Glil(Glioma-associated Oncogene Homolog l，Glil)最初是在研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤時發(fā)現(xiàn)并命名的一個基因，其編碼的Glil蛋白是Hh信號途徑最重要的下游轉(zhuǎn)錄因子之一，也是Hh信號最終的響應(yīng)者和功能的執(zhí)行者。Hh-Glil信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中處于一種調(diào)節(jié)紊亂的異常激活狀態(tài)，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其上游配體Shh信號的存在對于膠質(zhì)瘤的生長及腫瘤干細胞的自我更新能力的維持有著重要

3、作用，其下游轉(zhuǎn)錄因子Glil可以通過調(diào)節(jié)CyclinDl，Bcl-2的表達水平參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖和凋亡，同時也與膠質(zhì)瘤的惡性程度和惡性生物學(xué)行為的維持密切相關(guān)。 Aquaporins(水通道蛋白，AQPs)是一類分布在細胞膜表面，能夠特異的對水分子進行快速高效跨膜轉(zhuǎn)運的小分子通道蛋白家族。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布的水通道蛋白是AQP1。近年來的研究發(fā)現(xiàn)AQPs與神經(jīng)系統(tǒng)的一些疾病尤其是腫瘤性疾病的進展有著密切的關(guān)系，AQP1

4、在膠質(zhì)瘤細胞向周圍組織的侵襲生長及瘤周組織的腦水腫形成方面都發(fā)揮了重要的作用，雖然已經(jīng)有大量的研究闡明了AQP1是如何通過自身的通道結(jié)構(gòu)對水分子進行跨膜轉(zhuǎn)運的，但是對其本身表達水平的高低受何種機制的調(diào)控尤其是它與主要信號通路之間的關(guān)系仍然知之其少。 本研究擬從一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤-神經(jīng)膠質(zhì)瘤入手，研究Hedgehog通路的異常激活與水通道蛋白AQP1之間的關(guān)系，旨在證明Hedgehog通路下游轉(zhuǎn)錄因子Glil對AQP1的

5、表達具有調(diào)控作用，闡明這種調(diào)控是在何種水平、以何種方式進行，并對這種調(diào)控作用對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響進行了初步探討。 實驗方法： 1．用免疫組織化學(xué)、免疫熒光共定位實驗和Western blot等方法研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Hedgehog通路的激活情況以及AQP1的表達情況，并對兩者之間的相關(guān)程度進行分析； 2．構(gòu)建包含AQP1啟動子區(qū)全長的Luciferase報告基因質(zhì)粒AQP1-Luc-F，將G

6、lil-myc與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)細胞，熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測Glil對AQP1-Luc-F激活程度的影響； 3．將Glil過表達質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細胞，收獲不同時間點及不同轉(zhuǎn)入劑量的樣品，RT-PCR觀察轉(zhuǎn)錄水平、Western blot觀察蛋白水平AQP1的表達變化： 4．設(shè)計合成Glil基因特異的干擾片段，構(gòu)建干擾載體，體外驗證有效后，研究干擾掉Glil后對AQP1報告基因活性及膠質(zhì)瘤細胞系中AQP1表達的影響； 5．建

7、立分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體、過表達Glil、及穩(wěn)定干擾Glil的三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系：L1251-PC3.1，U251-Glil，L1251-PGl，Western Blot方法檢測三種細胞系中AQP1表達水平的變化； 6．將報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)入三種不同的穩(wěn)定細胞系中，檢測AQP1轉(zhuǎn)錄活性的變化； 7．分析AQP1啟動子區(qū)，根據(jù)Glil的核心結(jié)合序列設(shè)計引物，運用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChiP)技術(shù)研究Glil與AQP1啟動子區(qū)的結(jié)合情況

8、； 8．根據(jù)ChIP實驗結(jié)果，利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建AQP1啟動子區(qū)突變報告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的穩(wěn)定細胞系中，利用報告基因檢測確定在Glil對AQP1調(diào)控中起關(guān)鍵作用的啟動子區(qū)段位置，闡明調(diào)控作用的機制； 9．利用Transwell和Wound healing assay實驗比較不同細胞系侵襲能力的差異，評價Glil在膠質(zhì)瘤細胞系中調(diào)控AQP1表達所引起的生物學(xué)功能變化。 結(jié)論： 本研究首次發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)

9、膠質(zhì)瘤中Hedgehog通路異?；罨cAQP1異常高表達兩種現(xiàn)象之間的關(guān)系，并且證實Hh通路下游轉(zhuǎn)錄因子Glil可以通過與AQP1啟動子區(qū)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對其表達進行調(diào)控，其中AQP1啟動子區(qū)-06--398段的DNA序列在這一調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用。在膠質(zhì)瘤細胞中這一調(diào)控作用的生物學(xué)意義是：Glil可以通過上調(diào)AQP1來增強膠質(zhì)瘤細胞的惡性侵襲能力。 第二部分： 研究背景和目的： Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

10、通路(Hh通路)是一條高度保守的，在生物的胚胎發(fā)育及多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用的信號通路。近年來的研究表明，在多種人類惡性腫瘤性疾病中(如腦膠質(zhì)細胞瘤、基底細胞癌、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌等)該通路都呈現(xiàn)出異常的活化狀態(tài)，并且對腫瘤的發(fā)生及發(fā)生后腫瘤組織的生長和惡性生物學(xué)特性的維持起著重要作用。人們在研究Hh通路與腫瘤之間關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，特異性抑制Hh通路可以抑制多種腫瘤細胞的增殖以及向其他器管侵襲轉(zhuǎn)移的能力。因此，Hedge

11、hog信號通路被認為是一條比較理想的可以作為腫瘤靶向治療的信號途徑，針對Hh通路的小分子抑制劑的開發(fā)及研究工作方興未艾，逐漸成為國際研究的熱點。 Jervine(介芬胺)是從藜蘆屬植物中提取的一種小分子天然產(chǎn)物，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于一種甾體類生物堿。Jervine可以與Hh通路上游激活因子Smo特異性結(jié)合而抑制該通路信號的傳遞，進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞的增殖的效應(yīng)，是一種具有潛在臨床應(yīng)用價值的小分子抑制劑。但是Jervine作為一種天

12、然產(chǎn)物，其抑制Hh通路活性的作用并不是很強且具有較大的化學(xué)毒性，這一缺陷限制和延緩了其作為一種新型抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用。 本研究擬以Jervine為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)修飾和改造的方法制備系列目標(biāo)衍生物；然后對制備的衍生物進行抑制Hh通路的特異性篩選及抗腫瘤活性篩選，并與已有的Hedgehog通路抑制劑的活性進行比較，最終期望獲得一到兩個高效、低毒、高特異性的Hedgehog通路抑制劑，并對結(jié)構(gòu)修飾規(guī)律作出總結(jié)，為新型抗腫瘤藥

13、物的研發(fā)提供基礎(chǔ)。 實驗方法： 1．結(jié)構(gòu)修飾衍生物的獲得：以Jervine為底物，分別經(jīng)醚化、N-烴化、N-?；?，N-甲基化、3-OH氯代等特異性化學(xué)修飾得到一系列衍生化合物； 2．衍生物高通量篩選平臺的構(gòu)建：在Hh通路組成性激活的NIH/3T3細胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以反應(yīng)Hh通路激活程度的報告基因Hh-reporter，將該細胞系命名為NIH/3T3-R，并對該細胞系反映Hh通路激活程度的敏感性進行鑒定；

14、3．初次篩選：以步驟2中構(gòu)建的穩(wěn)定細胞系為篩選工具，將步驟1中得到的衍生物以8uM濃度作用于體外培養(yǎng)的C3H-3T3-R，36h后測定報告基因數(shù)值，觀察各化合物對Hh通路的抑制效應(yīng)，得到可以相對特異性抑制Hh通路活性的化合物； 4．二次篩選：細胞活性檢測再次篩選步驟3中得到的化合物對體外培養(yǎng)的NIH/3T3-R的細胞毒性，排除初篩過程中報告基因數(shù)值的降低是由于化合物本身的毒性導(dǎo)致細胞死亡所致，得到對細胞增殖抑制不明顯，但可以顯著

15、抑制報告基因活性的毒性低、特異性好的衍生物； 5．RT-PCR及Western blot檢測步驟4中得到的化合物對NIH/3T3細胞中Hh通路下游轉(zhuǎn)錄因子Glil表達的抑制作用，進一步驗證化合物的特異性； 6．CCK8法檢測經(jīng)二次篩選得到的衍生物在體外對腫瘤細胞的增殖抑制作用；裸鼠荷瘤實驗，將得到的化合物以不同劑量灌胃給藥，觀察其對體內(nèi)腫瘤的生長抑制作用；最終得到具有較高的抗腫瘤活性、低毒高效的Hh通路抑制劑；

16、結(jié)論： 本研究以Jervine為先導(dǎo)化合物，首先經(jīng)特異性結(jié)構(gòu)修飾改造得到一系列衍生物，然后對衍生物在抑制Hh通路的特異性、體內(nèi)外毒性、抗腫瘤活性等方面的特性進行連續(xù)篩選，最終得到四個特異性較好、毒性較低、抗腫瘤活性較強的陽性化合物，其中有三個化合物在上述特性上與陽性對Cyclopamine(環(huán)杷明)類似，一個化合物要優(yōu)于環(huán)杷明。對所得陽性化合物的結(jié)構(gòu)改造位點與先導(dǎo)化合物Jervine的結(jié)構(gòu)進行比較分析可以得出以下規(guī)律：3-OH氧