五個(gè)雙芐基異喹啉生物堿與BCRP的相互作用以及CYP3A5對其代謝激活作用.pdf

1、雙芐基異喹啉類生物堿是一類結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)芐基基團(tuán)以及四氫異喹啉基團(tuán)的生物堿，許多含有這類生物堿的植物在中國以及其他國家地區(qū)都是用來治療疾病的傳統(tǒng)藥材。本文選擇了5個(gè)結(jié)構(gòu)類似并具有多種藥理活性的雙芐基異喹啉生物堿，分別是蓮心堿、甲基蓮心堿、異蓮心堿、蝙蝠葛堿和漢防已堿作為研究對象，一方面應(yīng)用建立的高表達(dá)乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resisitance protein，BCRP)的LLC-PK1/BCRP細(xì)胞模型，研究這些

2、生物堿與BCRP的相互作用，探究BCRP對它們的體內(nèi)處置過程及藥理活性的潛在影響;另一方面應(yīng)用建立的WI-38/3A5細(xì)胞模型，研究CYP3A5對這些生物堿的代謝激活作用和在肺毒性中所起的作用，闡明這類生物堿產(chǎn)生肺毒性的機(jī)理。
　　1.LLC-PK1/BCRP細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特征
　　為建立高表達(dá)BCRP的細(xì)胞模型，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-BCRP轉(zhuǎn)入LLC-PK1細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)G418篩選后

3、，采用細(xì)胞群體倍增試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等方法鑒定;以體外細(xì)胞毒試驗(yàn)，檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型對米托葸醌和阿霉素的耐藥指數(shù);用熒光倒置顯微鏡，檢測其對熒光染料Hoechst33342的外排作用;并以GF120918為BCRP抑制劑，觀察抑制劑對BCRP外排熒光染料的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果表明，LLC-PK1/BCRP細(xì)胞高表達(dá)BCRP蛋白;細(xì)胞群體倍增時(shí)間較親本細(xì)胞略有延長;對米托蒽醌和阿霉素的耐藥指數(shù)分別增加至51.92倍和6.

4、09倍;對熒光染料Hoechst33342的外排作用明顯增強(qiáng)，且可被抑制劑GF120918逆轉(zhuǎn)。因此高表達(dá)BCRP的豬腎小管上皮細(xì)胞-LLC-PK1/BCRP細(xì)胞構(gòu)建成功，可作為進(jìn)一步研究BCRP與藥物相互作用的模型。
　　2.五個(gè)雙芐基異喹啉類生物堿與BCRP的相互作用
　　本研究應(yīng)用構(gòu)建的LLC-PK1/BCRP細(xì)胞模型研究BCRP與5個(gè)生物堿的相互作用特性。體外研究結(jié)果可以提示BCRP在生物堿的體內(nèi)處置過程中和藥理活性

5、的發(fā)揮中的潛在影響。我們通過MTT試驗(yàn)測定了5個(gè)生物堿對LLC-PK1和LLC-PK1/BCRP細(xì)胞的毒性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度設(shè)計(jì)提供依據(jù);進(jìn)行細(xì)胞積聚實(shí)驗(yàn)和雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)這5個(gè)生物堿是否為BCRP的底物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這5個(gè)生物堿透過生物膜的能力并不強(qiáng)，除甲基蓮心堿在最高濃度下(30μmol/L)的Papp值在5×10-6cm/s左右外，其余幾個(gè)生物堿的Papp值均小于3.5×10-6cm/s。蓮心堿是BCRP的底物，在雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

6、中，低濃度下(10μmol/L)，它的凈外排比為2.87;但是隨著給藥濃度的升高，蓮心堿的凈外排比有所下降，提示BCRP對蓮心堿的轉(zhuǎn)運(yùn)存在飽和現(xiàn)象;細(xì)胞積聚實(shí)驗(yàn)也顯示蓮心堿在LLC-PK1/BCRP細(xì)胞內(nèi)的積聚量顯著少于LLC-PK1細(xì)胞。蝙蝠葛堿是BCRP的弱底物，雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的凈外排比在1.6左右，并且在LLC-PK1/BCRP細(xì)胞內(nèi)的積聚量略少于LLC-PK1細(xì)胞。而異蓮心堿、甲基蓮心堿和漢防己堿均不是BCRP的底物。為在蛋白分子

7、水平上揭示BCRP與這5個(gè)生物堿的相互作用情況，找出參與相互作用的氨基酸殘基，進(jìn)行了分子對接計(jì)算。計(jì)算結(jié)果顯示，蓮心堿與482位精氨酸殘基和490位蘇氨酸殘基可各形成一條氫鍵;蝙蝠葛堿與BCRP有疏水相互作用。由此可知，BCRP可外排蓮心堿和蝙蝠葛堿，對它們的藥理活性和體內(nèi)處置過程可能存在影響。
　　3.CYP3A5在五個(gè)雙芐基異喹啉類生物堿的代謝激活中的作用
　　前期在動(dòng)物上進(jìn)行的組織分布研究表明，這5個(gè)生物堿在肺內(nèi)的分布

8、濃度均較高;蝙蝠葛堿和漢防己堿大劑量腹腔注射給藥時(shí)可產(chǎn)生嚴(yán)重的肺毒性?？赡苁怯捎谇捌谶M(jìn)行的關(guān)于甲基蓮心堿、異蓮心堿和蓮心堿的研究給藥劑量均較低，它們的肺毒性還未見報(bào)道。文獻(xiàn)推測蝙蝠葛堿與漢防己堿的肺毒性與CYP3A酶介導(dǎo)的代謝激活相關(guān)，由于在肺內(nèi)表達(dá)的CYP3A亞族的酶為CYP3A5，因此，為研究CYP3A5在蝙蝠葛堿等的肺毒性中所起的作用，建立了WI-38/3A5細(xì)胞模型。通過MTT、MTS和LDH試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)生物堿在WI-38/3

9、A5細(xì)胞上的毒性均強(qiáng)于WI-38/Vector細(xì)胞，其中漢防己堿的毒性最強(qiáng)。通過檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平、GSH水平和細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)CYP3A5在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的升高，使?jié)h防己堿對細(xì)胞的毒性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CYP3A5基因的WI-38細(xì)胞加入漢防已堿處理后，細(xì)胞存活率更低，胞內(nèi)ROS水平更高，GSH水平更低，細(xì)胞凋亡的情況更嚴(yán)重。這說明，CYP3A5參與了漢防己堿的代謝激活，是漢防已堿引起肺毒性的原因之一。由于蓮心堿、異蓮心堿和