胡椒堿衍生物的熒光分析與蛋白的相互作用研究.pdf

1、胡椒堿是蓽茇中提取的有效成分之一。胡椒堿衍生物是以胡椒堿作為原料,用化學(xué)方法合成的一系列胡椒堿衍生物。蓽茇是胡椒科植物蓽茇(Piper longumL.)的未成熟果穗,是常用于中、蒙、藏藥。臨床研究證明蓽茇具有明顯的降血脂作用。內(nèi)蒙古大學(xué)蒙藥研究所從蓽茇中得到胡椒堿及與胡椒堿具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的胡椒堿衍生物,發(fā)現(xiàn)其中的胡椒堿和蓽茇寧具有顯著降血脂活性。另外,根據(jù)胡椒堿和蓽茇寧的分子結(jié)構(gòu),以胡椒堿為原料合成了一系列胡椒堿衍生物。胡椒堿衍生物

2、中胡椒酸乙酯(簡(jiǎn)稱為GBA)的降血脂活性好,毒性非常小,具有開發(fā)成降血脂創(chuàng)新一類藥的研究?jī)r(jià)值。以開發(fā)新藥為目的研究胡椒堿衍生物時(shí),尋找和確定一種能夠快速、簡(jiǎn)便、精確、高效地檢測(cè)胡椒堿衍生物的分析方法是十分必要。另外在研究胡椒堿衍生物的藥物代謝和作用機(jī)理方面有必要研究生物體內(nèi)血液中胡椒堿衍生物與血清白蛋白的結(jié)合情況等基礎(chǔ)研究工作。 首次詳細(xì)研究了金屬離子存在下,胡椒堿在膠束體系中的熒光特性,以及實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響,建立了靈敏

3、度較高、穩(wěn)定性較好的熒光分析新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：陽離子表面活性劑溴化十六烷基三甲基銨對(duì)錳(Ⅱ)-胡椒堿的熒光具有增敏作用。胡椒堿的質(zhì)量濃度在2.02～10.1μg·mL-1范圍內(nèi),與其熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,檢出限為0.0602μg·mL-1,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10％。該方法應(yīng)用于蒙藥蓽茇中胡椒堿的測(cè)定,結(jié)果滿足分析要求。 研究發(fā)現(xiàn)非離子表面活性劑OP-10對(duì)蓽茇寧的熒光有明顯的增敏作用,據(jù)此首次建立了測(cè)定蓽茇寧的熒光分析新

4、方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蓽茇寧的質(zhì)量濃度在2.0～16.0μg·mL-1范圍內(nèi),與其熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系,檢出限為0.0651μg·mL-1,方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.40％。該方法應(yīng)用于蒙藥蓽茇中蓽茇寧的測(cè)定,結(jié)果令人滿意。 采用熒光光譜及紫外光譜法研究了胡椒堿、蓽茇寧和GBA與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。確定胡椒堿、蓽茇寧和GBA分別都與BSA形成復(fù)合物,從而猝滅BSA的內(nèi)源性熒光。猝滅的主要原因是靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)

5、移作用。計(jì)算得到胡椒堿、蓽茇寧和GBA與BSA的結(jié)合常數(shù)KA,分別為1.02×107L·mol-1(25℃)和1.11×107L·mol-1(37℃);2.40×105 L·mol-1(25℃)和1.01×106 L·mol-1(37℃);9.48×105L·mol-1(25℃)和1.36×106L·mol-1(37℃)。得到胡椒堿、蓽茇寧和GBA與BSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,分別為1.45(25℃)和1.46(37℃);1.10(25℃)和1

6、.24(37℃);1.18(25℃)和1.24(37℃)。根據(jù)Forster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論得到胡椒堿、蓽茇寧和GBA與BSA的結(jié)合距離r,分別為3.28 nm(25℃)和3.30nm(25℃);3.12 nm(25℃)和3.15 nm(37℃);2.68 nm(25℃)和2.81 nm(37℃)。通過熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算,確定胡椒堿、蓽茇寧和GBA與牛血清白蛋白的相互作用均是一個(gè)熵增加和吉布斯自由能降低的自發(fā)過程。根據(jù)熱力學(xué)參

7、數(shù)與作用力之間的關(guān)系,確定主要作用力為疏水作用力。通過同步熒光光譜研究了BSA構(gòu)象的變化。并進(jìn)一步討論了常見金屬離子對(duì)胡椒堿衍生物與BSA的相互作用的影響。 采用熒光光譜及紫外光譜法研究了胡椒堿、蓽茇寧和GBA及胰蛋白酶(trypsin)的相互作用。確定胡椒堿、蓽茇寧和GBA與胰蛋白酶形成復(fù)合物從而猝滅胰蛋白酶的內(nèi)源性熒光。猝滅原因主要為靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移。計(jì)算得到胡椒堿、蓽茇寧和GBA與胰蛋白酶的結(jié)合常數(shù)KA,分別為9.

8、29×105 L·mol-1(25℃)和1.44×106 L·mol-1(37℃); 1.19×106 L·mol-1(25℃)和9.57×105 L·mol-1(37℃);1.66×106 L·mol-1(25℃)和5.05×105 L·mol-1(37℃)。根據(jù)Forster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論得到胡椒堿、蓽茇寧和GBA與胰蛋白酶的結(jié)合距離r,分別為2.79nm(25℃)、3.02 nm(37℃),3.08 nm(25℃)、2.93