異喹啉生物堿與核酸結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系及應(yīng)用研究.pdf

1、許多生物小分子的生理活性都與各種結(jié)構(gòu)的核酸分子的相互作用密切相關(guān)，探究小分子與核酸結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系具有十分重要的生物意義。因此，本論文選用三鏈DNA、分子信標及脫堿基位點DNA為研究對象。根據(jù)對不同結(jié)構(gòu)的異喹啉生物堿與核酸之間相互作用的研究，分別開發(fā)了pH和金屬離子調(diào)控的分子開關(guān)、靈敏度可調(diào)的免標記分子信標以及手性熒光傳感器。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.以異喹啉生物堿作為選擇劑、穩(wěn)定劑、誘導劑以及開關(guān)信號的三鏈DNA熒光傳感

2、　　三鏈DNA逐漸在多個領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，諸如基因表達、藥物篩選、分子開關(guān)以及傳感器等。然而，其應(yīng)用都取決于三鏈結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定。研究了多種結(jié)構(gòu)的異喹啉生物堿對三鏈DNA的識別，發(fā)現(xiàn)天然小分子白屈菜紅堿(CHE)對特異性識別三鏈結(jié)構(gòu)的選擇性最高，隨著三鏈DNA與CHE的結(jié)合，DNA的三鏈結(jié)構(gòu)部分穩(wěn)定性逐漸增強而雙鏈結(jié)構(gòu)部分的穩(wěn)定性沒有任何影響。CHE能夠誘導易形成三鏈的寡核苷酸鏈(TFO)與其對應(yīng)的雙鏈部分結(jié)合形成三鏈DNA。由

3、于CHE與三鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合能夠使其熒光強度明顯增強，因此，CHE可以作為檢測三鏈結(jié)構(gòu)的有效分子探針。利用CHE作為特異性的選擇劑、誘導劑以及開關(guān)信號，成功地設(shè)計了這種pH和金屬離子調(diào)控的免標記三鏈納米開關(guān)。
　　2.可調(diào)的免標記三鏈分子信標用于DNA分析
　　核酸序列的檢測在現(xiàn)代生命科學中占有十分重要的地位。分子信標操作簡單、反應(yīng)靈敏并且具有高度的選擇性，一直是人們的研究熱點。在此，由于三鏈DNA結(jié)構(gòu)對溶液pH較為敏感，設(shè)計了一

4、種靈敏度可調(diào)的免標記tMB。由于天然小分子CHE能夠與三鏈結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合并熒光增強，且能夠穩(wěn)定三鏈結(jié)構(gòu)并誘導其形成，選用了CHE作為開關(guān)信號。不加入靶標序列時，tMB莖部呈三鏈結(jié)構(gòu)與CHE結(jié)合，熒光信號響應(yīng);加入靶標序列與環(huán)狀部分結(jié)合后，環(huán)狀部分形成剛性雙鏈結(jié)構(gòu)從而將莖部的三鏈體破壞，熒光信號明顯降低，而加入含有變異堿基(G/C)的靶標序列，與環(huán)狀部分不能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)而不能明顯破壞莖部的三鏈結(jié)構(gòu)，熒光信號基本不變。改變?nèi)芤簆H能使tMB

5、三鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也隨之發(fā)生變化，可以調(diào)控對序列檢測的靈敏度。
　　3.基于雙鏈DNA的手性熒光傳感器
　　運用生物大分子對天然手性對映異構(gòu)體的快速識別有助于手性傳感器的發(fā)展以及加快藥物的開發(fā)。在這項工作中，首次運用含有AP位點的雙鏈DNA來探究其區(qū)分對映體的能力。選用一種能夠與AP位點特異性結(jié)合的熒光團用作熒光探針，以天然的四氫巴馬汀(THP)為代表性對映體，開發(fā)了一種可用于直接檢測的手性傳感器。發(fā)現(xiàn)，由于L-THP能夠特異

6、性與AP位點結(jié)合(L-THP的結(jié)合常數(shù)高出D-THP兩個數(shù)量級)，因此只有L-THP能夠有效取代AP位點原本結(jié)合的熒光團而使體系熒光強度明顯增強。通過熒光滴定、等溫滴定量熱法以及DNA熔解實驗確定L-THP與AP位點的結(jié)合強于D-THP，并且可以通過改變AP位點的數(shù)目以及其側(cè)翼序列調(diào)節(jié)該傳感器區(qū)分對映體的能力。對單個手性原子誘導的異構(gòu)體的區(qū)分，單個AP位點便能夠提供一個完美的結(jié)合空腔。這項工作基于雙鏈DNA開發(fā)的手性熒光傳感器進一步推動