荷葉生物堿單體的分離純化及其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞作用的構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、荷葉(Lotus leaf)是睡蓮科植物蓮的葉，在我國(guó)的分布十分廣泛。荷葉中含有大量的生物活性成分如生物堿、黃酮、β-胡蘿卜素、多糖、有機(jī)酸、揮發(fā)性油類(lèi)、甾體、皂類(lèi)等，擁有抑菌、抗氧化、抗病毒和降脂減肥等作用，因而受到人們的廣泛關(guān)注。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，目前關(guān)于荷葉降脂減肥作用的研究主要集中于荷葉生物堿粗提物對(duì)高脂血癥大鼠的作用研究，而關(guān)于荷葉提取物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞作用的報(bào)道較少，荷葉生物堿單體對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的作用及其構(gòu)

2、效關(guān)系則未見(jiàn)報(bào)道。隨著人們生活水平的提高，肥胖尤其是肥胖兒童的增多，越來(lái)越引起人們的關(guān)注，因此開(kāi)發(fā)出綠色、健康的降脂減肥食品或藥物具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文以荷葉為對(duì)象，研究荷葉生物堿提取物及其單體對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖、周期、凋亡以及分化的作用，并進(jìn)一步探索荷葉生物堿發(fā)揮預(yù)防肥胖作用的有效成分，研究結(jié)果可為天然降脂減肥食品或藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。得到研究結(jié)果如下:
　　(1)采用酸性乙醇溶液超聲提取法，得到荷葉生物堿粗提

3、物，并將其作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞，測(cè)定其對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡以及分化的相關(guān)作用。研究結(jié)果表明，荷葉生物堿粗提物能有效地抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖，并呈劑量時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)，作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞24 h、48 h、72 h的IC50值分別為171μg/mL、153μg/mL、129μg/mL，作用效果顯著。荷葉生物堿粗提物能顯著作用3T3-L1前脂肪細(xì)胞的周期，并將其阻滯于G0/G1期，從而能顯著抑制細(xì)胞增殖。PI/An

4、nexinⅤ-FITC雙染結(jié)果顯示荷葉生物堿粗提物能誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。在加入荷葉生物堿提取物后，3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化受到了不同程度的抑制，且隨著加入濃度的升高，抑制作用也隨之增強(qiáng)，當(dāng)作用濃度為100μ g/mL時(shí)，前脂肪細(xì)胞的分化OD值下降了36.7％，具有顯著性差異。
　　(2)采用制備型高效液相色譜分離制備得到了6種荷葉生物堿單體，通過(guò)質(zhì)譜、薄層色譜、紫外光譜以及分析型高效液相色譜鑒定

5、，并對(duì)照文獻(xiàn)推測(cè)可能為原荷葉堿、亞美罌粟堿、巴婆堿、O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿，純度分別為91.9％、93.8％、83.5％、96.7％、91.8％、94.2％。首先使用制備型高效液相色譜進(jìn)行荷葉生物堿的分離，制備條件為流動(dòng)相乙腈和0.05％氨水配比為48∶52，進(jìn)樣濃度為10 mg/mL，進(jìn)樣量2mL/次，流動(dòng)相流速為8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。在此條件下，分離制備得到4種荷葉生物堿單體，分別為巴婆堿、O

6、-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿，再通過(guò)二次制備，條件為流動(dòng)相乙腈和0.05％氨水配比為28∶72，進(jìn)樣濃度為10 mg/mL，進(jìn)樣量2 mL/次，流動(dòng)相流速為8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，在此條件下分離得到原荷葉堿和亞美罌粟。
　　(3)將分離純化得到的6種荷葉生物堿單體分別作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞，測(cè)定其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖、周期、凋亡以及分化的相關(guān)作用，并進(jìn)一步分析其構(gòu)效關(guān)系。研究結(jié)果表明，

7、6種生物堿單體對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果為N-去甲基荷葉堿＞巴婆堿＞O-去甲基荷葉堿＞荷葉堿，而原荷葉堿和亞美罌粟堿幾乎沒(méi)有抑制效果。對(duì)細(xì)胞周期的影響研究表明，巴婆堿將細(xì)胞阻滯于G2/M期，O-去甲基荷葉堿將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，N-去甲基荷葉堿與荷葉堿均將細(xì)胞阻滯于S期。通過(guò)比較4種單體的促細(xì)胞凋亡作用，得到其作用效果由高到低為N-去甲基荷葉堿、巴婆堿、O-去甲基荷葉堿、荷葉堿，其作用效果基本與細(xì)胞的增殖抑制相類(lèi)似。比較荷葉堿與N-去甲基