柑橘屬常用中藥材陳皮、青皮次生代謝產(chǎn)物之揮發(fā)油成分研究.pdf

1、蕓香科 Rutaceae柑橘屬 Citrus L.植物藥用歷史悠久，許多常見中藥材如陳皮、青皮、枳實(shí)、枳殼、化橘紅、橘紅、橘葉、橘絡(luò)、橘核、佛手等均來(lái)自該屬植物。源于該屬的藥材在中藥性效、化學(xué)成分、藥理作用等方面既存在共性，又各具特征。代表性藥材陳皮 Citri Reticulatae Pericarpium(CRP)、青皮 Citri Reticulatae Pericarpium Viride(CRPV)即充分體現(xiàn)了這一特點(diǎn)。陳皮、

2、青皮同來(lái)源于柑橘屬柑橘 Citrus reticulata Blanco種及其變種，因不同的采收期而成為兩味中藥。陳皮為9～12月果實(shí)成熟時(shí)采摘的果皮；青皮為5～6月收集自落的幼果（個(gè)青皮），或7～8月采收的未成熟果實(shí)的果皮（四花青皮）。陳皮、青皮均為理氣藥，但臨床應(yīng)用和作用特點(diǎn)各有不同。陳皮的功效為理氣健脾，燥濕化痰；青皮的功效為疏肝破氣，消積化滯。陳皮長(zhǎng)于理氣健脾，青皮長(zhǎng)于疏肝破氣。陳皮作用部位主要在中上焦，青皮主要在中下焦。二者來(lái)

3、源相同，是體現(xiàn)中藥“一體二用”的代表?！耙惑w二用”是指來(lái)源于同一基原植物和同一入藥部位，因不同的生長(zhǎng)期采收而成為功效、作用特點(diǎn)、臨床應(yīng)用不同的兩味中藥。陳皮和青皮因有相同的遺傳背景和次生代謝產(chǎn)物合成途徑，可將二者作為模式藥物進(jìn)行中藥“一體二用”的研究。
　　陳皮、青皮的活性成分主要包括揮發(fā)油、黃酮成分。目前，關(guān)于陳皮、青皮的研究報(bào)道主要集中于黃酮類成分，而對(duì)具有較強(qiáng)生物活性的揮發(fā)油關(guān)注較少。已有的研究表明，揮發(fā)油是陳皮、青皮產(chǎn)生理

4、氣作用的主要部位。陳皮、青皮具有相同的性味，但其調(diào)氣作用有強(qiáng)弱之別，陳皮為理氣健脾，青皮為疏肝破氣?；诖?，從臨床作用和化學(xué)成分的相關(guān)性考慮，理氣作用的強(qiáng)弱應(yīng)與其揮發(fā)油中所含主要成分含量有關(guān)；《中國(guó)藥典》2010版僅以橙皮苷一個(gè)成分作為陳皮、青皮藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)，并未將揮發(fā)油成分納入品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，這不能全面的反映陳皮、青皮品質(zhì)；此外，由于柑橘揮發(fā)油優(yōu)良的芳香品質(zhì)及豐富的資源，它被認(rèn)為是制作食品、飲料、化妝品的主要香料來(lái)源。鑒于此，本文

5、對(duì)陳皮、青皮揮發(fā)油成分做了一較系統(tǒng)、全面、深入的研究。研究結(jié)果為揭示闡明“品種-成分-性效”相關(guān)性，中藥“一體二用”的科學(xué)內(nèi)涵奠定了一定的基礎(chǔ)；并對(duì)柑橘果皮的綜合利用，橘皮精油的產(chǎn)業(yè)化建設(shè)，促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。
　　具體研究?jī)?nèi)容及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.陳皮、青皮揮發(fā)油提取、GC-MS分析方法學(xué)研究
　　1.1提取方法學(xué)研究
　　在實(shí)驗(yàn)室已建立方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)及實(shí)際操作，確定了一較好的提取

6、方案。目前國(guó)際上，對(duì)于新鮮柑橘果皮精油的提取主要采用壓榨法，因?yàn)檫@能充分地保障橘皮精油優(yōu)良的芳香品質(zhì)。但由于陳皮、青皮是以干燥的橘皮入藥，因此壓榨法并不適用于兩藥揮發(fā)油的提取。基于此，本研究仍采用經(jīng)典的水蒸汽蒸餾提取法，具體方案如下：取粉碎后的樣品約10～30 g與約10倍量（V/W）蒸餾水（mL）于40℃時(shí)在一揮發(fā)油提取器(Clevenger-type apparatus)中溶脹1 h，隨后提取揮發(fā)油3～4 h，得無(wú)色或淡黃色澄明油狀

7、液體。提取完畢后，即讓揮發(fā)油在提取裝置中靜置1 h，后讀取揮發(fā)油的量（mL），并收集。揮發(fā)油于約5℃時(shí)通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水24 h，后裝于具塞小瓶，置于冰箱中，以備氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer, GC-MS）分析所需。計(jì)算揮發(fā)油的收率（v/w）。結(jié)果表明該方法切實(shí)可行，提取效果較好。從各樣品揮發(fā)油得率看：廣陳皮的揮發(fā)油得率（3.56～8.71％）明顯高于其他陳皮、青皮（<0.7～4

8、.2%）。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，為了確保有足夠的揮發(fā)油（≥0.1 mL）供分析用，應(yīng)當(dāng)確保樣品的量為：廣陳皮不少于10 g（貯藏年限較長(zhǎng)的廣陳皮價(jià)格較高），其他陳皮、青皮不少于25 g，提取溶劑用量約為樣品量的10倍（V/W）。
　　1.2 GC-MS分析方法學(xué)研究
　　同樣地，在實(shí)驗(yàn)室已有分析方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)系統(tǒng)查閱文獻(xiàn)及實(shí)際操作，確定本研究中采取的方法為：Agilent7890A/5975C GC-MS氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（

9、美國(guó)），匹配一化學(xué)工作站MSD ChemStation E.02.01.1177，質(zhì)譜圖匹配的譜庫(kù)為NIST(National Institute of Standards and Technology，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所)08 MS database。色譜柱HP-5MS5%Phenyl Methyl Siloxane(30 m×0.25 mm×0.25μm)。
　　柱箱升溫程序：初始溫度60℃，保持3 min，以4℃/min

10、的速率升至250℃。載氣為He，恒定流速1mL/min。進(jìn)樣口（氣化溫度），離子源的溫度分別為280，230℃。分流比20:1。溶劑延遲：3.00 min。電離方式：EI(Electron impact)源；電子能量：70 eV；質(zhì)量范圍(m/z)：30～350 amu；掃描間隔：2.29 scans s-1。進(jìn)樣前，樣品被稀釋為10%的n-hexane（正己烷）溶液。進(jìn)樣量1μL。
　　通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，以上參數(shù)還可進(jìn)一步的優(yōu)化，

11、具體有：由于在藥材FCI-1-b，F(xiàn)CI-2-b，F(xiàn)CI-3-b揮發(fā)油中鑒定的化合物Pentacosane（正二十五烷）的分子量為352，超出了350的上限，因此恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)量范圍(m/z)應(yīng)為：30～400 amu。
　　2中藥揮發(fā)油成分定性方法學(xué)研究——以陳皮、青皮為例
　　2.1中藥揮發(fā)油總離子流譜圖中重疊峰的拆分
　　中藥揮發(fā)油是一個(gè)十分復(fù)雜的體系，含有數(shù)以百計(jì)的化學(xué)成分，且許多成分性質(zhì)相近，這導(dǎo)致應(yīng)用 GC-MS

12、分析得到的總離子流譜圖(Total ion chromatogram, TIC)中存在著大量的重疊、甚至內(nèi)嵌峰。如何對(duì)這些重疊峰進(jìn)行拆分，并定性，將對(duì)揮發(fā)油成分的正確分析起到至關(guān)重要的作用。本研究應(yīng)用氣-質(zhì)化學(xué)工作站(ChemStation)匹配的AMDIS(Automated Mass Spectral Deconvolution& Identification System,自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng))拆分中藥揮發(fā)油TIC中的重疊峰；并

13、首次系統(tǒng)、深入地闡述了如何應(yīng)用該程序拆分中藥揮發(fā)油TIC中的重疊峰（以陳皮、青皮為例）。該研究具有較好的創(chuàng)新性和實(shí)用性，對(duì)于解決色譜分析中色譜峰重疊問(wèn)題具有很好的啟示作用。研究結(jié)果表明， AMDIS能初步分析TIC中含有多少化合物。而后，通過(guò)對(duì)各待鑒定化合物對(duì)應(yīng)掃描點(diǎn)提純譜圖及該掃描點(diǎn)原始譜圖與參考譜庫(kù)中各匹配化合物的比對(duì)、分析，確定其結(jié)構(gòu)；或否定某處提純譜圖及其對(duì)應(yīng)的化合物（即此提純譜圖并不合理，其對(duì)應(yīng)的化合物實(shí)際并不存在）。進(jìn)一步，

14、通過(guò)選擇各化合物的特征性碎片離子峰，并分析它們的變化規(guī)律，可確認(rèn)已有的鑒定結(jié)果。尤其，當(dāng)被鑒定物濃度較低，且受到干擾時(shí)，AMDIS分析方法具有較大優(yōu)勢(shì)。它能有效去除干擾并獲得“純凈”的譜圖信息，從而增大目標(biāo)化合物定性的可靠性。不過(guò)，當(dāng)2個(gè)化合物的保留時(shí)間十分接近時(shí)，AMDIS有可能會(huì)漏檢?？傊?，AMDIS的提純質(zhì)譜圖的功能，可有效地對(duì)重疊峰中混合質(zhì)譜圖進(jìn)行拆分，進(jìn)而準(zhǔn)確的對(duì)各物質(zhì)定性。
　　2.2 Kováts保留指數(shù)在中藥揮發(fā)油

15、成分定性中的作用
　　隨著GC-MS的普及，現(xiàn)在，對(duì)于中藥揮發(fā)油成分的定性主要通過(guò)MS完成。但是僅僅依靠MS對(duì)化合物定性是不夠的，因?yàn)樵S多萜烯類化合物有著基本相同的質(zhì)譜。因此對(duì)于補(bǔ)充質(zhì)譜數(shù)據(jù)而言，一些關(guān)于保留行為的知識(shí)是非常需要的。這其中最著名的就是Kováts于1958年提出的保留指數(shù)(Retention index, RI)概念。本研究應(yīng)用 Van den Dool與 Kratz提出的公式計(jì)算程序升溫保留指數(shù)(temperat

16、ure-programmed retention indices, ITP)。
　　研究結(jié)果表明，保留指數(shù)在中藥揮發(fā)油成分定性中發(fā)揮著重要作用，具有很大的參考價(jià)值。對(duì)于中藥揮發(fā)油成分的鑒定，應(yīng)將MS與保留指數(shù)結(jié)合起來(lái)，保留指數(shù)和其它手段綜合定性是氣相色譜發(fā)展的重要趨勢(shì)之一。
　　3中藥揮發(fā)油成分定量方法學(xué)研究——以陳皮、青皮為例
　　應(yīng)用2.2中的方法對(duì)TIC中的譜峰定性，定性后的色譜峰采用總體積積分和歸一化法進(jìn)行定量

17、，并假定所有化合物的響應(yīng)因子均為1。盡管面積歸一化法是一較粗略的定量方法，但由于其操作簡(jiǎn)便，因此本研究中仍采用此方法定量。對(duì)于TIC中的重疊峰，應(yīng)用AMDIS拆分定性后，通過(guò)各定性化合物的特征性碎片離子峰對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行一大致的峰面積定量。研究結(jié)果表明，此方法切實(shí)可行，數(shù)據(jù)可靠。
　　4同來(lái)源陳皮、青皮揮發(fā)油成分比較研究
　　由于陳皮、青皮的來(lái)源復(fù)雜，為了確保一個(gè)真正的比較研究，實(shí)驗(yàn)中的藥材均首次采用了定種、定產(chǎn)地、定植株（1棵

18、或相鄰的幾顆）的方法進(jìn)行收集。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中各批次藥材的提取方法也相同。因此遺傳因素，生態(tài)環(huán)境，及技術(shù)參數(shù)的影響均被去除，一個(gè)真正的比較分析實(shí)驗(yàn)得以進(jìn)行。共對(duì)來(lái)源于2個(gè)變種：大紅袍（產(chǎn)地：重慶市璧山縣、四川夾江馬村）、椪柑（產(chǎn)地：四川蒲江）總計(jì)19批藥材進(jìn)行了研究。
　　研究結(jié)果表明不同采收時(shí)間的陳皮、青皮（大紅袍、椪柑）揮發(fā)油成分在性質(zhì)、含量上均有一定的差異。并且源于不同變種的陳皮、青皮在揮發(fā)油大類成分上均呈現(xiàn)一致的變化規(guī)律：即隨

19、著采收時(shí)間的延長(zhǎng)，單萜烯類成分的含量呈現(xiàn)先升高，再降低的趨勢(shì)；含氧化合物含量呈現(xiàn)先降低，再升高的趨勢(shì)。以揮發(fā)油成分含量為變量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果將不同采收期橘皮分為3類：早期采收的橘皮、中期采收的橘皮、晚期采收的橘皮，這與按采收期不同將橘皮分為個(gè)青皮、青皮、陳皮3類一致。
　　5不同貯藏年限廣陳皮（新會(huì)陳皮）揮發(fā)油成分對(duì)比研究
　　研究結(jié)果表明源于茶枝柑的不同貯藏年限的廣陳皮（新會(huì)陳皮）擁有幾乎相同的物質(zhì)基礎(chǔ)。直觀及聚類分析均

20、表明：貯藏期為4年的新會(huì)陳皮揮發(fā)油成分與其他5批貯藏年限更長(zhǎng)的新會(huì)陳皮有較顯著性差異，后5批之間的差異性并不顯著。與4年新會(huì)陳皮相比，后5批廣陳皮總單萜烯類化合物含量有所升高，而總含氧化合物含量則降低。這表明，就揮發(fā)油類成分而言，陳皮確實(shí)需要“陳”，但這種“陳”也是有限度的，“陳”到一定程度即達(dá)到最佳。具體的變化趨勢(shì)和內(nèi)在規(guī)律還需要在今后的研究中做進(jìn)一步探討。傳統(tǒng)認(rèn)為，陳皮在存放過(guò)程中，揮發(fā)性成分多已揮發(fā)，使得其他成分能更好地發(fā)揮藥理作

21、用。但本研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，揮發(fā)油的得率并未降低，這說(shuō)明揮發(fā)油類成分仍是新會(huì)陳皮發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　6陳皮、青皮、橘皮揮發(fā)油化學(xué)型分析
　　Lota等根據(jù)化合物檸檬烯（Limonene）與γ-萜品烯（γ-Terpinene）的含量，將來(lái)源于不同柑橘變種果皮揮發(fā)油的化學(xué)型分為兩類：檸檬烯（83.8～96.2%）型與檸檬烯/γ-萜品烯（52.2～81.3%/11.2～36.7%）型。受 Lota的啟發(fā)，并在L

22、ota的基礎(chǔ)上，本研究首次系統(tǒng)分析了源于不同變種、不同產(chǎn)地陳皮、青皮（橘皮）揮發(fā)油的化學(xué)型。已有的研究結(jié)果表明，區(qū)分陳皮、青皮揮發(fā)油的化學(xué)型主要看4個(gè)物質(zhì)的含量高低，即：檸檬烯、γ-萜品烯、芳樟醇（Linalool）、2-甲氨基苯甲酸甲酯（Benzoic acid,2-(methylamino)-, methyl ester）。據(jù)此，本研究中來(lái)源于大紅袍、椪柑的陳皮、青皮（橘皮）揮發(fā)油歸屬于檸檬烯/芳樟醇型；源于茶枝柑的廣陳皮揮發(fā)油歸屬

23、于檸檬烯/γ-萜品烯/2-甲氨基苯甲酸甲酯化學(xué)型。
　　7揮發(fā)油成分在陳皮、青皮品質(zhì)評(píng)價(jià)中的作用
　　本研究表明，揮發(fā)油成分在陳皮、青皮品質(zhì)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中具有重要作用。首先，同來(lái)源的陳皮、青皮揮發(fā)油成分具有顯著性差異，并且這種差異的總體特征在來(lái)源于不同變種、不同產(chǎn)地的陳皮、青皮均一致。直觀分析及聚類分析均表明：這種變化趨勢(shì)與傳統(tǒng)的按采收時(shí)間將橘皮分為個(gè)青皮、青皮、陳皮3種類型也是一致的。其次，就揮發(fā)油成分而言，陳皮中來(lái)源于茶枝柑

24、的道地藥材“廣陳皮”與其他陳皮、青皮具有顯著性差異。從化學(xué)型上來(lái)看，廣陳皮具有一特殊的化學(xué)型；另從揮發(fā)油在藥材中的含量來(lái)看，廣陳皮也明顯高于其他陳皮、青皮。因此可以推斷，廣陳皮之所以成為道地藥材，并顯現(xiàn)比其他陳皮更好的藥效，揮發(fā)油成分發(fā)揮了重要的作用。據(jù)此，建議《中國(guó)藥典》在今后的版本中將揮發(fā)油成分納入陳皮、青皮品質(zhì)評(píng)價(jià)體系，具體如下：化學(xué)型概念，得率，籍此將廣陳皮與其他陳皮區(qū)分；揮發(fā)油成分中兩大主成分（總單萜烯、總含氧化合物）的含量比