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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
第一部分 無(wú)血清饑餓法同步化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞效果評(píng)價(jià)
目的:
評(píng)價(jià)傳統(tǒng)的無(wú)血清饑餓法同步化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人外周血淋巴細(xì)胞以及Molt-4細(xì)胞的效果。
方法:
將在體外培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人外周血淋巴細(xì)胞和Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)到無(wú)血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。收集細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡(Annexin-V/PI)、增殖(Ki67)和Cycl
2、in E的表達(dá)水平。
結(jié)果:
隨著體外饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)(24、48h),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人外周血淋巴細(xì)胞凋亡率由(32.27±2.90)%增加到(61.82±2.47)%;ki67陽(yáng)性率由(67.20±8.54)%減少到(51.87±0.59)%;G1期CyclinE+細(xì)胞的比例由饑餓前的(63.35±4.99)%分別減少至(46.04±1.84)%和(44.46%±2.97)%;S期細(xì)胞比例由饑餓前的(12.43±1.4
3、2)%分別增加到(16.73±0.96)%和(20.70±1.86)%;G2/M期細(xì)胞的比例由饑餓前的(1.49±0.98)%分別增加到(5.18±1.00)%和(8.06±1.38)%。
將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48h后也得到了類(lèi)似的結(jié)果。
結(jié)論:
按照傳統(tǒng)的無(wú)血清饑餓法操作,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人外周血淋巴細(xì)胞以及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Molt-4細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓24、48
4、h,盡管凋亡率增加,增殖率下降,但是饑餓48h的時(shí)候處于S期的細(xì)胞比例依舊高達(dá)20%,并未同步化至靜止期。所以傳統(tǒng)的無(wú)血清饑餓法并不能使對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞完全同步化。
第二部分 非同步化正常人外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞周期限制點(diǎn)的研究
目的:
在非同步化的正常人淋巴細(xì)胞中探索細(xì)胞周期限制點(diǎn)(Restriction Point,R-point)存在的真實(shí)性,為其存在于G1期而非G0期提供證據(jù)。
方法:
5、 新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、18、24h后一部分轉(zhuǎn)入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h。收集細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CyclinE表達(dá),分析G1-cyclinE-、G1-cyclinE+、S和G2/M各期陽(yáng)性細(xì)胞比例;另一部分轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)檢測(cè)CyclinE表達(dá),分析G1-cyclinE-、G1-cyclinE+、S和G2/M各期陽(yáng)性細(xì)胞比例、G0/
6、G1期中P21表達(dá),同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的增殖(Ki67)以及DNA摻入(BrdU)水平。
結(jié)果:
1、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、12、18、24、48h后,S期比例增加,靜止期的細(xì)胞逐漸進(jìn)入細(xì)胞周期。
2、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、18、24h后分別轉(zhuǎn)入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,此過(guò)程中S期細(xì)胞比例在13%到24%
7、不等,不能實(shí)現(xiàn)同步化細(xì)胞的緩慢釋放進(jìn)入細(xì)胞周期。
3、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,盡管G1期細(xì)胞有75%左右表達(dá)CyclinE,但并未有細(xì)胞進(jìn)入S期;18h后轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中,S期、G2/M分別有19%、2%左右細(xì)胞表達(dá)CyclinE;24h后轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中,S期、G2/M中CyclinE的表達(dá)率則分別有23%和3.7%左右。
4、新
8、鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,細(xì)胞Ki67陽(yáng)性表達(dá)率僅有(7.83±1.36)%,18h和24h則分別增加到(21.89±2.72)%和(39.98±7.51)%。
5、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,BrdU摻入率僅有(2.18±1.37)%,而18h和24h BrdU摻入率則分
9、別增加到(5.23±0.53)%和(12.06±3.49)%。
6、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,G0/G1期細(xì)胞P21陽(yáng)性表達(dá)率為(82.45±4.61)%,而18h和24h則分別降到(49.89±19.11)%和(41.09±15.55)%。
結(jié)論:
1、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后會(huì)逐漸進(jìn)入細(xì)
10、胞周期,作為細(xì)胞周期限制點(diǎn)的研究對(duì)象更加科學(xué)合理。
2、新鮮分離的人外周血淋巴細(xì)胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),此過(guò)程中S期細(xì)胞始終保持較高比例,不能實(shí)現(xiàn)同步化細(xì)胞的緩慢釋放進(jìn)入細(xì)胞周期,所以轉(zhuǎn)入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中無(wú)法完成細(xì)胞周期限制點(diǎn)的研究。
3、本研究首次證實(shí),在非同步化的正常人外周血淋巴細(xì)胞中確實(shí)也存在細(xì)胞周期限制點(diǎn),且存在于G1期而非G0期。對(duì)于經(jīng)過(guò)1
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