生長抑素Ⅱ型受體與鼻咽癌的實驗研究.pdf

1、生長抑素(Somatostatin，SST)作為一種抑制肽對各種分泌和增殖效應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。它對生長激素分泌和釋放以及處于基礎(chǔ)狀態(tài)和受刺激狀態(tài)下的多種內(nèi)分泌、外分泌細(xì)胞功能均具有強大的抑制效應(yīng)。位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的SST可作為神經(jīng)遞質(zhì)，發(fā)揮調(diào)節(jié)大腦運動和識別功能的生物學(xué)效應(yīng)。SST并可以抑制多種如腸粘膜、激活的淋巴細(xì)胞、以及炎癥細(xì)胞等正常分裂細(xì)胞的增殖。 SST的生物學(xué)效應(yīng)是由機體內(nèi)廣泛分布著的與多種信號傳導(dǎo)通路結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受

2、體家族SST受體(Somatostatin Receptor，SSTRl—5)所介導(dǎo)的。SSTRl-5分別在不同的組織中有不同的表達。已經(jīng)證實在消化道以及大部分神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤活檢組織和體外培養(yǎng)的細(xì)胞株中有SSTR尤其是亞型SSTR2的表達。目前已經(jīng)證明某些非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中亦有不同程度的SSTR表達。 由于天然生長抑素肽的半衰期短，人工合成了多種生長抑素類似物SSTA(Smatostatin Analogues)，如八肽類

3、生長抑素類似物奧曲肽，臨床常用于治療消化內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，并用于治療肢端肥大和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。近來國內(nèi)外多種研究證實奧曲肽對多種非內(nèi)分泌惡性腫瘤細(xì)胞如肺癌、乳腺癌、大腸癌等有抑制作用。 目前SSTA抗腫瘤作用機制尚未明了，一般認(rèn)為包括：(1)直接作用： 類似物與腫瘤細(xì)胞表達的SSTR結(jié)合直接發(fā)揮作用；(2)間接作用：SSTA抑制促腫瘤生長的激素及生長因子如GH、胰島素樣生長因子—1（IGF—1)，抑制血管形成、收縮血管減

4、少腫瘤血供，間接抑制腫瘤生長。SSTR亞型在人類SST受體陽性腫瘤中顯示出一種特異性的亞細(xì)胞定位，不同的受體亞型表現(xiàn)為生長抑素抗腫瘤增殖效應(yīng)獨特的信號傳導(dǎo)通路。生長抑素受體的分布情況為SSTA用于腫瘤的診斷與治療提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。鼻咽癌是一種嚴(yán)重危害我國南方(廣東、廣西、湖南、福建)及東南亞地區(qū)人們生命健康的惡性腫瘤之一。在我國鼻咽癌死亡率約占全部惡性腫瘤死亡率的2.81％，居第八位，是我國重點防治的十大腫瘤之一。有著強大的生物學(xué)效

5、應(yīng)的SST在耳鼻喉頭頸外科中的研究很少。僅新加坡學(xué)者Loh KS利用放射自顯影檢測鼻咽癌病理組織切片SSTRS表達，發(fā)現(xiàn)有SSTR2高表達，鼻咽部非腫瘤組織標(biāo)本無SSTR2表達。其他有關(guān)生長抑素與鼻咽癌的體內(nèi)外實驗尚未見報道。本研究旨在探討生長抑素Ⅱ型SSTR2在鼻咽癌中的表達情況并在體內(nèi)外實驗中探討SSTR2激動劑奧曲肽抗鼻咽癌腫瘤增殖效應(yīng)。 目的： 1．明確SSTR2在鼻咽癌標(biāo)本中的表達情況，探討其表達是否與疾病的

6、發(fā)生發(fā)展以及臨床分期有關(guān)。 2．明確SSTR2激動劑是否能經(jīng)SSTR2的介導(dǎo)在體外實驗中取得抗體外鼻咽癌細(xì)胞株增殖能力以及促進該腫瘤細(xì)胞的凋亡。 3．明確SSTR2激動劑能否在體內(nèi)實驗中取得抗鼻咽癌增殖的效果。 方法： 1．鼻咽癌標(biāo)本的SSTR2檢測 45例鼻咽癌病人為四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻喉科門診病人，取活檢病理確診。分別取癌腫組織、癌旁組織和10例正常人群鼻咽部組織。做免疫組化和原位雜交檢測SS

7、TR2的表達，并以免疫組化方法分期檢測血管生長因子VEGF和MVD的表達。 2。生長抑素Ⅱ受體激動劑對體外生長鼻咽癌細(xì)胞株增殖能力及凋亡的影響 細(xì)胞爬片，初步測試SSTR2表達情況。分別加入l×10<'-7>，1×10<'-8>，l×10<'-9>M三種濃度的SSTR2激動劑奧曲肽于體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE中，顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)繪制生長曲線。用MTT法對鼻咽癌細(xì)胞株CNE進行不同濃度藥物作用下細(xì)胞增殖狀況的影響觀察，三

8、種濃度的奧曲肽作用CNE細(xì)胞24、48、72小時測試OD值。免疫組化測試分別以10<'-7>、10<'-8>、10<'-9> M濃度的奧曲肽作用24小時后SSTR2、PCNA、NF-KBp65表達，進行圖像分析。以透射電鏡以及TUINEL技術(shù)法觀察細(xì)胞的凋亡。 3．生長抑素Ⅱ受體激動劑對體外荷瘤裸鼠鼻咽癌腫瘤生長的影響 于裸鼠皮下接種鼻咽癌細(xì)胞，待其成瘤后，以100g／kg／d奧曲肽注射于瘤體周圍兩周，每三天測量一次，

9、觀察瘤體體積的變化。并處死裸鼠，取瘤體稱重，統(tǒng)計學(xué)分析，原位雜交檢測SSTR2 的表達。并檢測VEGF和MVD的表達情況。 結(jié)果： 1．鼻咽癌腫瘤組織中有較高的SSTR2表達，與分期無相關(guān)性。正常鼻咽部組織中未檢測到SSTR2表達，癌旁1.5cm處組織檢測，27.3％(3／11)有SSTR2陽性表達。VEGF在鼻咽癌組織中高表達，與正常組織、癌旁組織差別有統(tǒng)計學(xué)意義。MVD隨鼻咽癌腫瘤分期的發(fā)展而密度值增加。SSTR2

10、與VEGF和MVD的表達呈正相關(guān)。 2．細(xì)胞爬片，免疫組化初步檢測細(xì)胞中有SSTR2表達。生長抑素Ⅱ型受體激動劑奧曲肽加入鼻咽癌體外培養(yǎng)CNE細(xì)胞株后生長曲線右移。MTT法觀察奧曲肽加入細(xì)胞株后，測試吸光度，計算抑制率，表明抑制細(xì)胞增殖明顯并與劑量相關(guān)。免疫組化測試分別以10<'-7>、10 <'-8>、10<'-9>M濃度的奧曲肽作用24小時后SSTR2表達降低、PCNA表達減少、NF-KBp65增加。透射電鏡觀察以及TUNE

11、L技術(shù)分析細(xì)胞凋亡明顯增加。 3．奧曲肽作用于荷瘤裸鼠，瘤體生長較未用藥組生長減緩，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。最后瘤體重量兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。原位雜交SSTR2表達用藥組明顯低于未用藥組，VEGF的改變無統(tǒng)計學(xué)意義，而MVD 表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： SSTR2在鼻咽癌組織中有高表達，與分期不相關(guān)。與VEGF及MVD表達呈正相關(guān)。體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE中有SSTR2表達。在培養(yǎng)基中加入SSTR2