大劑量GC對PVN神經(jīng)元合成CRH的調(diào)節(jié)及機制研究.pdf

1、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)作為下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)最上級的激素，啟動了HPA軸對應(yīng)激原的應(yīng)答；同時，CRH也參與了交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的活化。因此，一般認為CRH是應(yīng)激過程中最重要的始動因子之一，CRH分泌增加可作為反映機體應(yīng)激狀態(tài)的客觀指標。 傳統(tǒng)認為，糖皮質(zhì)激素(GC)與其胞漿受體(iGR)結(jié)合后，可通過直接或間接方式抑制CRH的表達。因此，大劑量GC應(yīng)對CRH具有非常強烈的負反饋抑制作用。 但

2、是，有研究顯示，大劑量(≥10-6mol/L)GC并不能完全抑制下丘腦CRH的生成，下丘腦仍可有明顯的CRH的合成與分泌。提示GC在CRH合成與分泌過程中可能還有更為復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用和機制存在。另一方面，此時血液GC濃度遠遠超出iGR結(jié)合飽合濃度(高出上千倍)，提示這些現(xiàn)象可能是通過經(jīng)典的GR以外的途徑發(fā)揮作用的，而與新近認識到的GC膜受體(mGR)可能有密切關(guān)系。因此，我們推測大劑量GC可能通過其細胞膜上受體mGR對下丘腦的CRH合成與

3、分泌具有一定的調(diào)節(jié)作用。 研究目的 本研究旨在通過(1)觀察大劑量GC對下丘腦CRH轉(zhuǎn)錄與合成的影響及規(guī)律，(2)尋找大劑量GC對下丘腦CRH轉(zhuǎn)錄與合成的非胞漿受體的可能調(diào)節(jié)途徑與機制，探討多種病理情況下CRH持續(xù)產(chǎn)生相關(guān)機制、臨床大劑量GC治療的機制與功效等，為大劑量GC在嚴重創(chuàng)傷早期的臨床救治中的應(yīng)用提供新的思路和認識。 主要步聚與方法 1.觀察大劑量GC對下丘腦室旁核(PVN)神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄和表達CRH

4、的影響。 觀察了在10-6mol/L地塞米松(DEX)、10-9mol/LDEX以及在糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486干預(yù)條件下，PVN神經(jīng)元CRHmRNA和其蛋白質(zhì)合成的變化，以探討大劑量GC對PVN神經(jīng)元CRH轉(zhuǎn)錄與合成的影響及規(guī)律。 2.探討大劑量GC對PVN神經(jīng)元細胞膜電生理活動的作用和影響。 神經(jīng)元大多生理功能的依賴于其細胞膜電活動的改變。因此，在前部分實驗基礎(chǔ)上，本部分實驗著重對比觀察和研究了10-6m

5、ol/LDEX、10-9mol/LDEX、以及RU486拮抗條件下對PVN神經(jīng)元自發(fā)放電的作用和影響，以探討大劑量GC是否可能通過神經(jīng)元細胞膜上的結(jié)合位點影響神經(jīng)元功能，研究mGR是否在其中起到作用。 3.研究大劑量GC對神經(jīng)元鈣離子通道的作用與特點，以及其對下丘腦PVN神經(jīng)元CRH轉(zhuǎn)錄與合成調(diào)節(jié)和影響。 利用膜片鉗全細胞記錄技術(shù)，對比研究10-6mol/L的DEX、10-9mol/LDEX、以及在RU486拮抗情況下他

6、們對PVN神經(jīng)元細胞膜鈣離子通道的影響；利用激光共聚焦顯微鏡掃描觀察加入DEX后，神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的動態(tài)變化，觀察DEX刺激后PVN神經(jīng)元的CRHmRNA和蛋白量的變化。以探討大劑量GC對細胞內(nèi)第二信使Ca2+的調(diào)節(jié)作用、以及胞內(nèi)Ca2+濃度變化對CRH轉(zhuǎn)錄合成的影響。 主要結(jié)果和結(jié)論 大劑量GC可促進PVN神經(jīng)元的CRHmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的表達。在給予10-6mol/LDEX后20min左右，PVN神經(jīng)元

7、胞漿內(nèi)出現(xiàn)CRHmRNA棕黃色染色陽性顆粒；30min左右，PVN神經(jīng)元出現(xiàn)CRH蛋白陽性著色的綠色熒光顆粒；60min后可見第三腦室背部的周圍腦組織出現(xiàn)綠色熒光顆粒，90min后大腦皮層區(qū)域也可見到綠色熒光；而10-9mol/LGC(生理劑量)作用后未見PVN神經(jīng)元出現(xiàn)CRH的mRNA和蛋白質(zhì)陽性染色。利用RU486預(yù)先拮抗所有GR后，10-6mol/L的DEX不能再促進PVN神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄或表達CRHmRNA和蛋白。 大劑量GC

8、能迅速明顯增強PVN神經(jīng)元細胞放電。10-6mol/LDEX可使PVN單位放電頻率迅速明顯增強，較正常狀態(tài)下增加90.88±35.94％，而生理劑量GC以及生理鹽水均未能誘導(dǎo)神經(jīng)元單位放電頻率增加。RU486預(yù)處理后，10-6mol/LDEX使PVN神經(jīng)元單位放電增加的作用被顯著抑制。 大劑量GC主要通過促進Ca2+內(nèi)流而影響PVN神經(jīng)元細胞膜的電活動增強，也主要通過增加細胞內(nèi)Ca2+濃度促進CRH的轉(zhuǎn)錄和表達。10-6mol/

9、LDEX可誘導(dǎo)出神經(jīng)元內(nèi)向鈣電流增加，升幅約為60.25±14.91％，并使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加。而生理劑量GC均未能誘導(dǎo)上述現(xiàn)象的產(chǎn)生。抑制L-型Ca2+通道后，10-6mol/L的DEX未能使細胞內(nèi)Ca2+熒光強度的改變，且CRH的mRNA和蛋白合成均明顯抑制。預(yù)先給予RU486可使10-6mol/LDEX的作用被明顯抑制。 綜上所述，提示大劑量GC可通過PVN神經(jīng)元細胞膜上的mGR，激活其L-型Ca2+通道，促進Ca2+